中性粒細(xì)胞胞外捕網(wǎng)促足細(xì)胞自噬的機(jī)制及鹽酸青藤堿的干預(yù)效應(yīng).pdf

1、目的：
　　足細(xì)胞(podocyte)是一種終末分化的臟層上皮細(xì)胞，通過交錯(cuò)形成的足突與內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜共同構(gòu)成腎小球?yàn)V過屏障。當(dāng)足細(xì)胞暴露于多種損傷因素，可引起活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)水平升高，從而導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白及DNA損傷。足細(xì)胞在維持腎臟有效濾過屏障中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，是多種腎小球疾病損傷的中心環(huán)節(jié)。
　　足細(xì)胞在腎臟炎癥反應(yīng)中能夠招募循環(huán)中的中性粒細(xì)胞至炎癥區(qū)域發(fā)揮免疫監(jiān)視和

2、炎癥保護(hù)作用。在炎癥過程中，中性粒細(xì)胞本身能夠分泌多種細(xì)胞因子、趨化因子及調(diào)節(jié)分子，從而激活更多中性粒細(xì)胞活化并募集循環(huán)中其它免疫細(xì)胞。中性粒細(xì)胞胞外捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NETs）是新近發(fā)現(xiàn)的一種中性粒細(xì)胞活化并釋放大量溶菌酶及染色質(zhì)纖維等自身組分，從而產(chǎn)生殺菌及免疫效應(yīng)的新形式。NETs過度形成或清除障礙導(dǎo)致大量自身組分暴露于免疫監(jiān)視，并作為內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)打破自身免疫耐受，成為多種腎臟疾

3、病的研究熱點(diǎn)。
　　自噬是一種維持細(xì)胞自身內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的保護(hù)性機(jī)制，通過處理并回收胞內(nèi)損傷蛋白或細(xì)胞器，以應(yīng)對(duì)細(xì)胞所處的各種不利因素。然而，過度自噬將導(dǎo)致細(xì)胞死亡。足細(xì)胞本身表現(xiàn)出較高的基礎(chǔ)自噬水平。近來發(fā)現(xiàn)ROS是細(xì)胞受到各種刺激因素發(fā)揮作用的“交匯點(diǎn)”，作為主要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳感器維持自噬，啟動(dòng)自噬小體形成并調(diào)節(jié)自噬過程，是自噬調(diào)節(jié)的上游分子。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOX)是細(xì)胞ROS產(chǎn)生的兩大主要來源之一。NOX是位于

4、細(xì)胞膜上的復(fù)合酶，由多種催化亞基和調(diào)節(jié)亞基組成，其中p47-phox是主要調(diào)節(jié)亞基，能夠定位在細(xì)胞膜并整合其它亞基，在NOX全酶激活中起到重要作用。腎素-血管緊張素系統(tǒng)在腎臟的病理生理發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)是其主要的效應(yīng)分子，足細(xì)胞上既表達(dá)AngⅡ受體，也能分泌AngⅡ。鹽酸青藤堿(SN)是一種具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)的生物堿，新近發(fā)現(xiàn)SN能夠通過降低神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞ROS水平發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用

5、。
　　基于上述研究，我們通過觀察NETs對(duì)足細(xì)胞AngⅡ分泌的影響及AngⅡ?qū)ψ慵?xì)胞自噬的影響，探討SN通過抑制ROS途徑干預(yù)AngⅡ誘導(dǎo)的足細(xì)胞自噬的可能機(jī)制，進(jìn)一步明確NETs在腎臟炎癥中對(duì)足細(xì)胞的損傷機(jī)制及SN可能的腎臟保護(hù)作用。
　　方法：
　　1.采用小鼠瓊脂糖明膠皮下埋植法獲取大量具有自發(fā)NETs傾向的中性粒細(xì)胞。人條件永生化足細(xì)胞(AB8/13)和鼠足細(xì)胞培養(yǎng)。
　　2.采用免疫熒光觀察中性粒細(xì)胞

6、形態(tài)和NETs形成情況，以及p47-phox亞基在細(xì)胞膜表達(dá)情況。
　　3.流式細(xì)胞術(shù)鑒定所分離中性粒細(xì)胞純度及測(cè)定足細(xì)胞ROS水平。
　　4.ELISA檢測(cè)NETs與足細(xì)胞共培養(yǎng)后上清的AngⅡ濃度
　　5.采用Western blot檢測(cè)足細(xì)胞LC3B總蛋白、p47-phox膜蛋白表達(dá)水平。
　　6.透射電鏡觀察足細(xì)胞自噬體形成。
　　結(jié)果：
　　1.皮下埋植瓊脂糖明膠能夠獲取大量高純度（達(dá)95.

7、7％）、具有自發(fā)NETs傾向的中性粒細(xì)胞。
　　2.NETs能夠增加足細(xì)胞AngⅡ分泌(p=0.027)。
　　3.SN能夠減少中性粒細(xì)胞NETs形成(p=0.002)。
　　4.SN本身不會(huì)增加足細(xì)胞LC3B蛋白比例，不影響自噬水平(p＞0.05)。
　　5.AngⅡ刺激后足細(xì)胞LC3B蛋白比例明顯增加（*P＜0.05），透射電鏡下觀察自噬小體數(shù)量明顯增加（P＜0.001）。SN干預(yù)后LC3B蛋白比例和自噬小體

8、數(shù)量均降低（分別為P＜0.05和P＜0.001）
　　6.AngⅡ能夠顯著增加足細(xì)胞ROS生成(P＜0.01)。經(jīng)不同濃度的SN(10-8～10-4 M)干預(yù)后ROS水平較AngⅡ刺激組顯著下降（P＜0.05、P＜0.01）。
　　7.AngⅡ能顯著增加足細(xì)胞p47-phox在細(xì)胞膜上表達(dá)，不同濃度的SN(10-8～10-4M)預(yù)處理后能抑制其表達(dá)(P＜0.001)。
　　結(jié)論：
　　1.皮下埋植瓊脂糖明膠法可獲