PRRSV感染誘導(dǎo)細(xì)胞自噬及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的機(jī)制研究.pdf

1、細(xì)胞自噬是一種溶酶體依賴性的降解途徑，在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。越來(lái)越多的研究顯示，細(xì)胞自噬在不同病毒感染的過(guò)程中扮演著不同的角色，同樣病毒對(duì)細(xì)胞自噬的調(diào)控機(jī)制也不盡相同。此外，細(xì)胞自噬還跟天然免疫存在著密切的關(guān)系。
　　 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)合成的重要場(chǎng)所，在蛋白的翻譯和修飾過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，病毒復(fù)制過(guò)程中往往導(dǎo)致大量未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白的堆積而引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進(jìn)而誘導(dǎo)未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)，UPR同樣跟病毒

2、的增殖存在重要的關(guān)系。此外，UPR可以調(diào)控細(xì)胞自噬的水平。
　　 豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)以引起妊娠母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道癥狀為主要特征，具有較高的死亡率。盡管隨著研究的深入取得了一系列的研究成果，但針對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)感染引起的免疫抑制及其對(duì)細(xì)胞的具體調(diào)控機(jī)制仍不甚明了。鑒于此，本研究深入探討了PRRSV感染后自噬及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的誘導(dǎo)情況。主要研究?jī)?nèi)容包括:
　　 1.PRRSV感染誘導(dǎo)自噬體

3、的形成
　　 為確定PRRSV感染是否誘導(dǎo)自噬體的形成，首先通過(guò)WesternBlot的方法檢測(cè)PRRSV感染后Ⅱ型微管結(jié)合蛋白輕鏈3(LC3-Ⅱ)的表達(dá)變化，結(jié)果顯示PRRSV感染明顯誘導(dǎo)了LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化，初步揭示了PRRSV感染可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬;進(jìn)一步我們通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察PRRSV感染后EGFP-LC3的定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PRRSV感染MARC-145細(xì)胞后融合表達(dá)蛋白EGFP-LC3發(fā)生明顯的點(diǎn)狀聚集，

4、進(jìn)一步證明PRRSV感染可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬;最后，通過(guò)透射電鏡對(duì)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，同時(shí)在陽(yáng)性對(duì)照組及PRRSV感染組中觀察到自噬體的存在，直接證明了PRRSV感染后可以誘導(dǎo)自噬體的形成。
　　 2.PRRSV感染促進(jìn)自噬體的降解
　　 兩種途徑可引起細(xì)胞內(nèi)自噬體的聚集:細(xì)胞自噬被誘導(dǎo)、自噬體的降解被抑制。為驗(yàn)證PRRSV感染誘導(dǎo)自噬體聚集的具體機(jī)制，首先通過(guò)Lyso-Tracker對(duì)溶酶體進(jìn)行染色，觀察EGFP-LC

5、3與溶酶體的共定位情況，證實(shí)PRRSV感染誘導(dǎo)的自噬體可以與溶酶體發(fā)生共定位，初步推斷PRRSV感染能促進(jìn)自噬體的降解。進(jìn)一步，通過(guò)WesternBlot分別對(duì)p62的降解情況和LC3-Ⅱ的周轉(zhuǎn)進(jìn)行了分析，結(jié)果證實(shí)PRRSV感染后促進(jìn)了p62的降解同時(shí)也促進(jìn)了LC3-Ⅱ的周轉(zhuǎn)。充分表明了PRRSV感染可以促進(jìn)自噬體的降解。
　　 3.細(xì)胞自噬促進(jìn)PRRSV的增殖
　　 研究中分別通過(guò)自噬抑制劑3-MA和自噬激活劑雷帕霉素

6、(Rapa)處理細(xì)胞，檢測(cè)抑制或激活細(xì)胞自噬對(duì)PRRSV增殖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬促進(jìn)PRRSV的增殖，而3-MA抑制細(xì)胞自噬后，PRRSV的增殖受到抑制。進(jìn)一步，通過(guò)設(shè)計(jì)干擾分子分別干擾ATG7和Beclin-1的表達(dá)，進(jìn)一步證明細(xì)胞自噬在PRRSV增殖過(guò)程中的促進(jìn)作用。另外，通過(guò)抑制劑和干擾分子分別抑制自噬溶酶體的形成，同樣顯著抑制了PRRSV的增殖。以上結(jié)果表明細(xì)胞自噬能夠促進(jìn)PRRSV的增殖。
　　 4.參與誘導(dǎo)細(xì)

7、胞自噬的PRRSV編碼蛋白
　　 為篩選參與誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的PRRSV編碼蛋白，首先用紫外光(UV)滅活的PRRSV感染MARC-145細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)UV滅活的PRRSV不具有誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的能力，初步推斷誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的為PRRSV的非結(jié)構(gòu)蛋白。進(jìn)一步通過(guò)轉(zhuǎn)染PRRSV編碼蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒，并通過(guò)WesternBlot檢測(cè)LC3-Ⅱ的表達(dá)變化情況，結(jié)果顯示多種PRRSV編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白均可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。
　　 5.PRRS

8、V誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬參與免疫抑制
　　 PRRS是一種強(qiáng)烈的免疫抑制性疾病，現(xiàn)已證實(shí)，PRRSV感染可以抑制由poly(I(:)C)誘導(dǎo)的干擾素的表達(dá)，而在對(duì)細(xì)胞自噬研究的過(guò)程中現(xiàn)已證實(shí)細(xì)胞自噬可以引起干擾素的下調(diào)。為此，我們通過(guò)熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒檢測(cè)PRRSV誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬是否參與其引起的免疫抑制，結(jié)果表明細(xì)胞自噬被抑制后PRRSV引起的免疫抑制得到恢復(fù)，這表明PRRSV誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬參與其引起的免疫抑制。
　　 6.PRR

9、SV感染MARC-145細(xì)胞誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激
　　 PRRSV感染細(xì)胞后，通過(guò)電鏡觀察其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的形態(tài)變化情況。發(fā)現(xiàn)PRRSV感染后可以引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的擴(kuò)張，推斷PRRSV感染可以引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激;進(jìn)一步通過(guò)WesternBlot檢測(cè)了糖調(diào)節(jié)蛋白78和94（GRP78和GRP94）的表達(dá)變化情況，證實(shí)PRRSV感染后可顯著誘導(dǎo)GRP78和GRP94的表達(dá)。表明PRRSV感染誘導(dǎo)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并誘發(fā)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。
　　 7.PRR

10、SV感染MARC-145細(xì)胞激活PERK途徑
　　 活化的PERK可以磷酸化轉(zhuǎn)錄起始因子2α(eIF2α)，為此本研究通過(guò)WesternBlot檢測(cè)了PRRSV感染后eIF2α的磷酸化水平，證實(shí)了PRRSV感染MARC-145細(xì)胞后eIF2α磷酸化水平顯著升高，而總的eIF2α未發(fā)生變化。進(jìn)一步我們檢測(cè)了ATF4的mRNA的表達(dá)變化情況，證實(shí)了磷酸化的eIF2α可以誘導(dǎo)ATF4的表達(dá)，最后研究證實(shí)了PRRSV感染后GADD34的

11、表達(dá)水平也明顯升高，這充分證明了PRRSV感染MARC-145細(xì)胞后，PERK的通路被激活。
　　 8.PRRSV感染MARC-145細(xì)胞激活I(lǐng)RE1途徑
　　 首先通過(guò)半定量的方法檢測(cè)了IRE1所誘導(dǎo)的Xbp1mRNA的切割情況，并最早在PRRSV感染24h后檢測(cè)到Xbp1s的存在，證實(shí)了PRRSV感染可以誘導(dǎo)Xbp1的切割，上述結(jié)論進(jìn)一步通過(guò)Xbp1的熒光素報(bào)告質(zhì)粒得到了佐證。之后通過(guò)熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒對(duì)受Xpb1調(diào)控

12、的兩個(gè)反應(yīng)元件（ERSE和UPRE）的活化進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明ERSE和UPRE在PRRSV感染后都被激活，最后通過(guò)熒光定量驗(yàn)證了受Xpb1調(diào)控的EMEM在PRRSV感染后同樣被激活，充分證明了PRRSV感染可以激活I(lǐng)RE1途徑。
　　 9.PRRSV感染MARC-145細(xì)胞不激活A(yù)TF6途徑
　　 ATF6的激活要通過(guò)切割實(shí)現(xiàn)，研究中通過(guò)WesternBlot檢測(cè)了PRRSV感染后ATF6的切割情況。發(fā)現(xiàn)PRRSV感染并

13、不誘導(dǎo)ATF6的切割，初步推測(cè)PRRSV感染不激活A(yù)TF6途徑;進(jìn)一步通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)了ATF6下游分子的表達(dá)變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PRRSV感染不能誘導(dǎo)其下游分子calnexin，calreticulin和PDI的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)PRRSV感染不能激活A(yù)TF6信號(hào)通路。
　　 10.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)促進(jìn)PRRSV增殖
　　 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)通常會(huì)影響病毒的增殖，為檢測(cè)PRRSV誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)其自身增殖的影響，本研究分

14、別通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的抑制劑和干擾分子阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，并進(jìn)一步通過(guò)空斑驗(yàn)證其對(duì)PRRSV增殖的影響。結(jié)果顯示，無(wú)論是抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，還是分別干擾其單條通路均能抑制PRRSV的增殖。
　　 11.PRRSV感染誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡
　　 PERK誘導(dǎo)的CHOP的表達(dá)通常被認(rèn)為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡的重要標(biāo)志。為此，我們首先通過(guò)CHOP的熒光素報(bào)告質(zhì)粒證實(shí)了PRRSV感染后可以顯著激活CHOP的表達(dá)，進(jìn)一步通過(guò)熒光定量

15、PCR對(duì)CHOP的mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行了驗(yàn)證，同樣證實(shí)了PRRSV感染可以誘導(dǎo)CHOP的mRNA的表達(dá)。此外，本研究進(jìn)一步通過(guò)ELISA試劑盒證實(shí)了PRRSV感染可以誘導(dǎo)caspase3的活化，直接證明了PRRSV感染可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而當(dāng)CHOP的表達(dá)被干擾后，caspase3的活化受到抑制，充分證明PRRSV感染可以誘導(dǎo)由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡。
　　 12.PRRSV誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控細(xì)胞自噬
　　 研究發(fā)現(xiàn)