豬鏈球菌2型誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)形成和逃避殺菌效應(yīng)及其機(jī)制的初步研究.pdf

1、豬鏈球菌是一種對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害十分嚴(yán)重的細(xì)菌。豬感染后的臨床癥狀主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)炎、腦膜炎、肺炎和敗血癥等，豬鏈球菌亦可感染人并導(dǎo)致發(fā)病及死亡。1998年在江蘇省和2005年在四川省爆發(fā)了人感染豬鏈球菌2型(SS2)的病例引起了較嚴(yán)重的臨床癥狀及高病死率。進(jìn)一步說(shuō)明SS2是一種重要的人獸共患傳染病病原，并導(dǎo)致了嚴(yán)重的公共衛(wèi)生危害。
　　中性粒細(xì)胞是細(xì)菌感染早期激活的免疫細(xì)胞，在控制豬鏈球菌感染過(guò)程中起著十分重要的作用。中性粒細(xì)胞的殺菌方

2、式主要有吞噬、脫顆粒和胞外誘捕網(wǎng)。其中，中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(Neutrophil extracellular traps，NETs)是指中性粒細(xì)胞在某些病原感染或者特殊物質(zhì)刺激的條件下會(huì)釋放自身細(xì)胞核內(nèi)的大量DNA到周圍組織來(lái)捕獲病原，并利用其所含有的殺菌物質(zhì)發(fā)揮其殺菌效應(yīng)，是一種新型的天然免疫機(jī)制已被廣泛接受。
　　前期的研究表明豬鏈球菌高毒力菌株可有效抵御中性粒細(xì)胞吞噬殺菌和脫顆粒殺菌作用。但關(guān)于NETs在豬鏈球菌感染中的作

3、用及機(jī)制還缺乏研究。因此，研究NETs在豬鏈球菌感染中的作用和機(jī)制對(duì)于揭示豬鏈球菌的致病機(jī)制有重要意義。本研究分別從體內(nèi)、體外水平開(kāi)展了中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)在豬鏈球菌2型感染中作用的研究。并進(jìn)一步利用非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法及相應(yīng)的信號(hào)通路抑制劑分析了豬鏈球菌2型誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞形成胞外誘捕網(wǎng)的主要信號(hào)通路。
　　首先，為了分析NETs在SS2感染時(shí)是否發(fā)揮作用，本研究通過(guò)熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，SS2感染小鼠后，其感染部位可以形成典型

4、的NETs結(jié)構(gòu)，說(shuō)明SS2感染時(shí)可以誘導(dǎo)NETs形成。之后，通過(guò)注射核酸酶破壞NETs結(jié)構(gòu)的方法評(píng)價(jià)了NETs在SS2感染中的作用。結(jié)果表明，使用核酸酶破壞NETs結(jié)構(gòu)后，感染小鼠血液中的載菌量和前炎癥因子TNF-α水平顯著升高，小鼠的臨床癥狀更加明顯，致死率顯著升高。表明NETs在小鼠感染SS2后細(xì)菌的清除以及炎癥因子水平控制上發(fā)揮重要作用。
　　盡管NETs在抵抗SS2感染中發(fā)揮重要作用，然而SS2仍可感染小鼠并導(dǎo)致其死亡，這

5、就說(shuō)明SS2可能存在逃避NETs殺菌效應(yīng)的機(jī)制。為了解釋這一現(xiàn)象，本研究利用體外實(shí)驗(yàn)解析了SS2逃避NETs殺菌作用的機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)不同毒力SS2菌株均可以誘導(dǎo)小鼠中性粒細(xì)胞形成NETs。進(jìn)一步比較NETs對(duì)這些SS2菌株的殺傷作用表明，不同毒力的SS2菌株均可以有效地逃避NETs殺菌，而缺失莢膜多糖(Capsular polysaccharides，CPS)的SS2菌株卻可以被NETs有效地殺傷，說(shuō)明SS2可以通過(guò)其CPS結(jié)構(gòu)逃避NE

6、Ts的殺菌效應(yīng)。通過(guò)熒光共聚焦顯微鏡分析NETs對(duì)細(xì)菌的捕獲發(fā)現(xiàn)，不同毒力的SS2菌株均可以逃避NETs的捕獲，而莢膜多糖基因缺失突變體可以明顯被其捕獲.說(shuō)明SS2的CPS結(jié)構(gòu)有助于SS2逃避NETs捕獲，并進(jìn)而逃避NETs的殺菌效應(yīng)。
　　由于NETs形成的機(jī)制尚不十分清楚，因此為了進(jìn)一步分析SS2誘導(dǎo)NETs形成的分子機(jī)制，本研究采用非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)的方法分別分析了SS2高致病性菌株05ZY誘導(dǎo)小鼠中性粒細(xì)胞形成NETs的

7、差異蛋白表達(dá)譜，并以PMA(Phorbol-12-myristate-13-acetate)刺激形成NETs作為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果顯示，PMA組與05ZY組細(xì)胞差異表達(dá)蛋白有75％是相符的。這些蛋白主要參與了核苷酸結(jié)合、核糖核酸結(jié)合、ATP結(jié)合等生命活動(dòng)。分別對(duì)PMA刺激組和05ZY感染組參與NETs形成的信號(hào)通路進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)05ZY感染后激活NETs形成的信號(hào)通路與PMA刺激組基本一致。其中，MPO活性、活性氧(Reactive oxy

8、gen species，ROS)產(chǎn)生、PKC(Protein kinase C)均參與了PMA或05ZY誘導(dǎo)形成NETs的過(guò)程。生物進(jìn)程分析表明有大量參與肌動(dòng)蛋白骨架重排的蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生變化。為研究肌動(dòng)蛋白在NETs形成過(guò)程中的作用，本研究使用肌動(dòng)蛋白聚合的抑制劑細(xì)胞松弛素B來(lái)探討肌動(dòng)蛋白聚合對(duì)NETs形成的作用。結(jié)果表明，細(xì)胞松弛素B處理后，PMA誘導(dǎo)的NETs水平顯著降低，但對(duì)SS2誘導(dǎo)的NETs水平無(wú)明顯影響，但具體機(jī)制尚不明確。