豬鏈球菌2型重組亞單位疫苗的研制.pdf

1、豬鏈球菌2型（Streptococcus suis serotype2， SS2）是一種人獸共患的傳染病病原，不僅可引起豬腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥、肺炎和突然死亡，還可感染相關(guān)人員并致死，在我國(guó)和其他養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達(dá)的國(guó)家已多次流行，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失.
　　 豬鏈球菌2型能產(chǎn)生多種毒力因子，如溶血素、溶菌酶釋放蛋白、胞外因子等.溶血素能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)作用，且各型豬鏈球菌均能產(chǎn)生生化和免疫特性相似的溶血素。因此

2、，溶血素能對(duì)各型鏈球菌感染產(chǎn)生交叉保護(hù)作用.對(duì)我國(guó)江蘇及其周邊地區(qū)的流行病學(xué)調(diào)查顯示，來自疫區(qū)的SS2均為對(duì)豬油強(qiáng)毒力的MRP+E F+表現(xiàn)型，由此可見MRP與EF在致病過程中的重要作用，本實(shí)驗(yàn)對(duì)具有免疫原性的MRP-EF與SLY蛋白進(jìn)行表達(dá)，以期制造出可以對(duì)豬鏈球菌2型進(jìn)行有效預(yù)防的基因工程疫苗.
　　 將已經(jīng)構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET32a-MRP-EF與pET32a-SLY轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中，優(yōu)化誘導(dǎo)時(shí)間、IPTG濃度、溫

3、度等誘導(dǎo)條件大量表達(dá)出分子量分別約為74kD和36kD的融合蛋白，并利用親和層析的方法純化兩種蛋白，兩種蛋白免疫轉(zhuǎn)印均可被SS2的抗血清識(shí)別，具有免疫原性.
　　 將純化好的豬鏈球菌2型MRP-EF與SLY重組蛋白作為抗原包被ELISA板建立檢測(cè)兩種免疫原產(chǎn)生抗體的ELISA方法。試驗(yàn)的最佳反應(yīng)條件為：抗原包被濃度分別為1.25μg/mL和0.78μg/mL，血清1:200稀釋；一抗反應(yīng)時(shí)間為90min，二抗反應(yīng)時(shí)間分別為60m

4、in和45min，具有較高的穩(wěn)定性、特異性和敏感性.
　　 通過基因工程技術(shù)分別表達(dá)了豬鏈球菌2型MRP-EF與SLY兩種重組蛋白，分別或1∶1混合，與不同佐劑混合乳化，設(shè)立免疫劑量梯度，免疫BALB/C小鼠，并以鏈球菌2型全菌滅活苗作對(duì)照，二免后用SS2-1活菌攻擊，并采集各組血清，間接ELISA測(cè)定效價(jià).結(jié)果顯示，試驗(yàn)組保護(hù)效果優(yōu)于對(duì)照組；MRP-EF+SLY免疫組的保護(hù)效果優(yōu)于其他試驗(yàn)組和對(duì)照組，其中25μg蛋白組合免疫的

5、小鼠保護(hù)力等同于50μg蛋白組合.試驗(yàn)證實(shí)兩種蛋白各25μg時(shí)為最佳免疫劑量.ISA佐劑效果最佳.
　　 取表達(dá)豬鏈球菌2型MRP-EF與SLY的兩種重組菌的表達(dá)產(chǎn)物rMRP-EF及rSLY，分別或1:1混合，與ISA206佐劑混合乳化，免疫仔豬，并以豬鏈球菌2型全菌滅活苗作對(duì)照.二免后用SS2-1活菌攻擊，并采集rMRP-EF/rSLY組及全菌滅活疫苗組仔豬的血清，間接ELISA測(cè)定效價(jià).結(jié)果顯示，rMRP-EF/rSLY組r