豬鏈球菌2型重要膜相關(guān)蛋白免疫效力研究.pdf

1、豬鏈球菌作為一種重要的人畜共患病病原，已經(jīng)越來越嚴(yán)重地危害到養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展和人類生命健康安全。，由于其血清型眾多，且不同型之間的交叉保護(hù)力差和菌株的變異性，到目前為止，對(duì)于該病原菌的防治依然缺乏有效的疫苗。盡管目前已有商品化的滅活疫苗，但是由于其仍然存在諸多缺點(diǎn)，如存在免疫副反應(yīng)、不能提供廣譜的免疫保護(hù)等，因此急需篩選鑒定出具有很好免疫原性，且通用型的亞單位疫苗候選抗原，并對(duì)這些蛋白的免疫機(jī)理進(jìn)行研究，為深入揭示豬鏈球菌2型的致病與免疫機(jī)理

2、奠定基礎(chǔ)。本研究選取了豬鏈球菌2型6個(gè)具有免疫原性的蛋白（分別是SSU0434、SSU0482、SSU0927、SSU1634、SSU1637和SSU1853），進(jìn)行免疫效果的研究，通過基因克隆，蛋白表達(dá)純化后進(jìn)行蛋白免疫效果的研究，旨在選取出免疫原性好，保護(hù)力較高的疫苗候選抗原，為開發(fā)新型的、有效的豬鏈球菌疫苗奠定基礎(chǔ)。主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　 1.SSU0434、SSU0482、SSU0927、SSU1634、SSU1637

3、和SSU1853蛋白的克隆、表達(dá)、純化參照P1/7基因組序列設(shè)計(jì)引物，以豬鏈球菌SC19基因組為模版擴(kuò)增基因(經(jīng)同源比對(duì)，目的基因同源性均為100％)，構(gòu)建SSU0434、SSU0482、SSU0927、SSU1634、SSU1637和SSU1853的原核表達(dá)載體。經(jīng)測(cè)序正確后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DE-3中，進(jìn)行蛋白表達(dá)。將表達(dá)正確的蛋白，大量誘導(dǎo)表達(dá)并純化，以備下一步實(shí)驗(yàn)用。
　　 2.6個(gè)膜相關(guān)蛋白SSU0434、SSU0482、

4、SSU0927、SSU1634、SSU1637和SSU1853對(duì)小鼠免疫保護(hù)力評(píng)價(jià)將上述表達(dá)純化的蛋白免疫小鼠，每組6只，二免后14天用SC19菌株，通過腹腔注射的方法，以2×109CFU/只的劑量攻毒，攻毒后觀察14天。結(jié)果表明，6個(gè)蛋白對(duì)小鼠的保護(hù)力分別為83.3％，83.3％，33.3％，66.7％，50％和83.3％。選出保護(hù)力較高的SSU0434、SSU0482和SSU1853進(jìn)一步對(duì)其免疫原性和免疫保護(hù)力進(jìn)行研究。
　

5、　 3.SSU0434、SSU0482和SSU1853單個(gè)蛋白和組合蛋白的的免疫原性和免疫保護(hù)力研究Western-blot結(jié)果顯示，SSU0434、SSU0482和SSU1853三個(gè)蛋白均能引起小鼠產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)。
　　 將表達(dá)純化的SSU0434、SSU0482、SSU1853和SSU0434-SSU0482-SSU1853蛋白免疫4周齡的Babl/C雌性小鼠，二免后14天攻毒，連續(xù)觀察14天，統(tǒng)計(jì)存活率分別為60％、

6、50％，60％和40％。
　　 用MTS方法做淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，測(cè)OD490nm。SSU0434和SSU0482蛋白均能刺激其免疫組小鼠脾臟的淋巴細(xì)胞增殖，而SSU1853蛋白不能刺激其免疫組小鼠脾臟的淋巴細(xì)胞增殖。將上述脾細(xì)胞培養(yǎng)48-72h后，收集細(xì)胞上清，檢測(cè)細(xì)胞因子IFN-γ和IL-6，與對(duì)照組相比，IFN-γ和IL-6水平顯著升高，說明小鼠體內(nèi)同時(shí)發(fā)生了Th1型和Th2型免疫反應(yīng)。
　　 SSU0434、SSU

7、0482、SSU1853和SSU0434-SSU0482-SSU1853均能刺激產(chǎn)生小鼠特異性的高滴度抗體，且IgG1和IgG2α抗體水平差異不顯著，說明小鼠體內(nèi)同時(shí)發(fā)生了Th1型和Th1型免疫反應(yīng)。
　　 4.SSU0434、SSU0482和SSU1853單個(gè)蛋白或3個(gè)蛋白組合后免疫血清被動(dòng)免疫實(shí)驗(yàn)每只小鼠注射100μL的免疫血清（分別是3個(gè)蛋白單免疫和組合免疫后的血清），每組8只小鼠，24小時(shí)后攻毒SC19菌株。連續(xù)觀察14

8、天，SSU0434，SSU0482、SSU1853和SSU0434-SSU0482-SSU1853保護(hù)力分別為87.5％、75％、62.5％，50％，說明在小鼠對(duì)SS2特異性的抵抗力中，SSU0434，SSU0482、SSU1853和SSU0434-SSU0482-SSU1853的特異性抗體可能起到一定的作用。
　　 5.SSU0434、SSU0482和SSU1853單個(gè)蛋白或3個(gè)蛋白組合后免疫血清的殺菌實(shí)驗(yàn)將各組蛋白的免疫血清