豬鏈球菌的PCR診斷及豬鏈球菌7型和9型國(guó)內(nèi)分離株的檢測(cè).pdf

1、豬鏈球菌(Streptococcus suis，SS)是一種重要的人畜共患病病原，根據(jù)菌體莢膜多糖抗原性的不同，分為35個(gè)血清型(1-34型，l／2型)。世界范圍內(nèi)以SS2流行最廣，致病性最強(qiáng)。國(guó)內(nèi)1991年在廣東省首次分離鑒定到SS2，隨后于1998年和2005年分別在江蘇和四川部分地區(qū)暴發(fā)人感染SS2并致人死亡，危害嚴(yán)重。 歐美等國(guó)家對(duì)豬鏈球菌毒力因子的研究發(fā)現(xiàn)菌株有多種基因型，致病性最強(qiáng)的基因型為cps2／epf+／mrp+／sl

2、y+。而國(guó)內(nèi)SS2分離株的毒力因子分布情況不很清楚，本實(shí)驗(yàn)對(duì)國(guó)內(nèi)SS2分離株的毒力因子進(jìn)行檢測(cè)。并與國(guó)外菌株的毒力因子分布情況進(jìn)行比較，為建立檢測(cè)致病性SS2的多重PCR方法提供依據(jù)。選取豬鏈球菌7種主要毒力因子—谷氨酸脫氫酶(gdh)、莢膜多糖(cps)、溶菌酶釋放蛋白(mrp)、胞外因子(epf)、溶血素(sly)、纖連蛋白／血纖蛋白原結(jié)合蛋白(fpbs)和毒力相關(guān)基因orf2，設(shè)計(jì)與合成7對(duì)引物，用PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示：2

3、5株SS2國(guó)內(nèi)分離株，96％(24／25)表現(xiàn)為cps2／gdh+／epf/mrp+／sly+/fbps+/orf2+，僅l株表現(xiàn)為cps2／gdh+／epf-／mrp+／sly+／fbps+／orf2+。l株SS7國(guó)內(nèi)分離株為cps7／gdh+／epf-／mrp-／sly+／fbps-/orf2+；2株SS9國(guó)內(nèi)分離株均為cps9／gdh+／epf-／mrp-／sly-／fbps-／orf2+，可見國(guó)內(nèi)SS2分離株的基因型比較相似，毒

4、力基因分布特征有特點(diǎn)，提示我國(guó)目前SS2的主要流行菌株是同時(shí)具有7種毒力因子的高致病菌株。 結(jié)合上述毒力因子分布情況，根據(jù)SS2的cps2J、mrp、orf2基因(virulent-associate　sequence orf2)設(shè)計(jì)合成三對(duì)引物，建立三重PCR檢測(cè)方法，并對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序、酶切、特異性及敏感性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示：26株SS2致病菌株(25株國(guó)內(nèi)病豬分離株，l株德國(guó)標(biāo)準(zhǔn)參考株)均同時(shí)擴(kuò)增出這三個(gè)目的片段，5株其它血清

5、型豬鏈球菌(SSl，SS7，SS9)及13株非豬鏈球菌的其它豬源鏈球菌(蘭氏B群，C群和D群)均未擴(kuò)增出cps2J和mrp段，檢測(cè)結(jié)果與菌株的已知毒力因子背景完全相符。26株SS2的PCR擴(kuò)增片段經(jīng)酶切鑒定，與預(yù)期結(jié)果一致。以SS2四川株ZY05719為模板的三重PCR產(chǎn)物(cps2，mrp,orf2)測(cè)序結(jié)果與GenBank上相關(guān)序列比較，同源性分別為99％、100％、94％，測(cè)序結(jié)果登錄GenBank，登錄號(hào)分別是cps2J(DQ2

6、07606)、mrp(DQ207605)、orf2(DQ207938)。該P(yáng)CR敏感極限是600CFU。本試驗(yàn)所建立的三重PCR特異性強(qiáng)、敏感性好，可用于實(shí)驗(yàn)室豬鏈球菌2型的快速鑒定，有利于豬鏈球菌病的監(jiān)測(cè)與控制。為了進(jìn)一步快速確定豬鏈球菌2型致病菌株主要毒力因子，本試驗(yàn)根據(jù)GenBank發(fā)表的豬鏈球菌gdh、cps2d、mrp及epf殳計(jì)并合成四對(duì)引物，建立四重PCR檢測(cè)方法，并對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行特異性及敏感性實(shí)驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果：25／

7、26的SS2致病菌株可同時(shí)擴(kuò)增出四個(gè)目的片段，1株SS2致病菌株缺失epf基因；13株非豬鏈球菌的陰性對(duì)照株均未擴(kuò)出四個(gè)目的片段，上述檢測(cè)結(jié)果與菌株的已知毒力因子背景情況完全相符；敏感極限為500CFU。因此所建立的多重PCR特異性強(qiáng)，敏感性好，適合實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，可輔助臨床診斷，有利于疾病的檢測(cè)與控制。 不同血清型的地區(qū)分布不同，除SS2外，SS9主要在德國(guó)、比利時(shí)、西班牙、荷蘭等地流行；芬蘭以SS7最為流行。為了解國(guó)內(nèi)是否存在除

8、SS2外的其他豬鏈球菌，本實(shí)驗(yàn)用建立的SSl、SS2、SS7、SS9的PCR方法，對(duì)送檢可疑菌株進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果結(jié)合其序列分析，確定其中一株為血清型7型，命名為SH040805；兩株為血清型9型，分別命名為SH040917、JX041226。進(jìn)一步用PCR方法對(duì)其毒力因子進(jìn)行檢測(cè)，并進(jìn)行小鼠致病性實(shí)驗(yàn)及藥敏實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示SH040805表現(xiàn)型為cps7／gdh+／epf-／mrp-／sly+／fbps-／orf2+；SH040917及

9、JX041226表現(xiàn)型均為cps9／gdh+／epf-／mrp-／sly／fops-／orf2+。SS2(HA9801)的LD<,50>為2.23；SS7(SH040805)的LD<,50>為2.08；SS9(SH040917)對(duì)小鼠不致病。國(guó)內(nèi)豬鏈球菌分離株均呈多重耐藥；尤其SS9耐藥性最嚴(yán)重，對(duì)磺胺類藥物、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類藥物高度耐藥。綜上可知，我國(guó)的豬群除ss2外還存在SS7、SS9；其毒力因子分布與國(guó)外同種血清型