自噬參與胰島素抵抗介導(dǎo)的足細胞損傷.pdf

1、目的:在全世界范圍內(nèi)，糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)已經(jīng)成為引起終末期腎臟病的一個首要原因。糖尿病腎病是糖尿病的一個嚴重并發(fā)癥，大約超過40％的2型糖尿病患者會出現(xiàn)這一并發(fā)癥。以往的研究表明，胰島素抵抗是糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)病原因和病程進展中的一個關(guān)鍵性因素。在糖尿病腎病領(lǐng)域，腎臟足細胞是腎小球當中的胰島素信號反應(yīng)細胞，失去胰島素敏感性的腎臟足細胞即使在正常的血糖條件下也會出現(xiàn)蛋白尿的表現(xiàn)，這說明足細胞中的

2、胰島素信號對于正常腎小球的功能是必不可少的。自噬是細胞內(nèi)的一種分解代謝過程，它通過聚集和降解功能障礙的細胞器來維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。自噬障礙與很多人類疾病密切相關(guān)，越來越多的證據(jù)表明調(diào)節(jié)自噬將會成為治療糖尿病的一個新靶點。目前關(guān)于在胰島素抵抗的足細胞中自噬過程是否發(fā)生改變?nèi)耘f是一個開放性的問題，而且關(guān)于自噬是否參與胰島素抵抗介導(dǎo)的腎臟足細胞損傷也不明確。本研究旨在探討:自噬在糖尿病腎病中的作用，并且主要著眼于自噬在發(fā)生胰島素抵抗的腎臟足細

3、胞中的作用。
　　方法:
　　1.用shRNA慢病毒感染腎臟足細胞，改變胰島素受體的表達，分別使用RT-qPCR及蛋白質(zhì)免疫印記(Wesrern Blot)方法來驗證敲除效率。
　　2.敲除胰島素受體后檢測足細胞自噬水平:
　　(1)蛋白質(zhì)免疫印記(western blot)檢測腎臟足細胞自噬水平的變化。200uM胰島素分別刺激正常組，對照組，胰島素受體敲除組，用Western Blot檢測p62，Beclin;

4、50um氯喹分別刺激或不刺激對照組，胰島素受體敲除組，用WesternBlot檢測LC3的變化。
　　(2)免疫熒光檢測腎臟足細胞自噬水平的變化。200uM胰島素分別刺激對照組，胰島素受體敲除組，用免疫熒光檢測p62，Beclin及LC3的表達。
　　(3)透射電鏡檢測腎臟足細胞自噬小體數(shù)量的變化。200uM胰島素分別刺激對照組和胰島素受體敲除組，利用電鏡檢測自噬小體的數(shù)量。
　　3.敲除胰島素受體后檢測足細胞功能蛋白

5、nephrin的變化:胰島素刺激腎臟足細胞，檢測nephrin蛋白的變化。200uM胰島素分別刺激正常組，對照組，胰島素受體敲除組，用western blot和免疫熒光檢測nephrin蛋白的變化。
　　4.應(yīng)用雷帕霉素激活自噬后檢測足細胞自噬水平和nephrin蛋白表達的變化。10uM雷帕霉素刺激胰島素受體敲除組，利用western blot檢測p62和nephrin;50uM氯喹分別刺激或不刺激雷帕霉素處理組，利用wester

6、n blot檢測LC3。
　　結(jié)果:
　　1.使用shRNA慢病毒感染腎臟足細胞可以減少胰島素受體的表達。（P＜0.05）
　　2.敲除胰島素受體后自噬水平降低。(1)免疫印記表明敲除胰島素受體的腎臟足細胞與對照組腎臟足細胞相比p62表達水平明顯升高，而LC3和Beclin1的表達水平明顯降低。(P＜0.05)(2)免疫熒光顯示敲除胰島素受體的腎臟足細胞與對照組腎臟足細胞相比p62表達水平升高，而LC3和Beclin1

7、的表達降低。(3)透射電鏡顯示敲除胰島素受體的腎臟足細胞與對照組腎臟足細胞相比自噬小體的數(shù)量明顯減少。
　　3.免疫印記和免疫熒光都表明敲除胰島素受體的腎臟足細胞與對照組腎臟足細胞相比nephrin的表達降低。
　　4.雷帕霉素刺激敲除胰島素受體的腎臟足細胞與未加入雷帕霉素的敲除胰島素受體的腎臟足細胞相比，自噬水平和nephrin的表達明顯升高。(P＜0.05)
　　結(jié)論:我們的結(jié)果表明當腎臟足細胞失去胰島素敏感性時自