中性粒細胞胞外誘捕網激活單核細胞在ANCA相關性血管炎的作用.pdf

1、目的：
　　抗中性粒細胞胞漿抗體(anti-neutrophil cytoplasmic antibodies，ANCA)相關血管炎(ANCA associated vasculitis，AAV)屬于自身免疫系統(tǒng)性小血管炎，病變常累及腎臟，主要表現(xiàn)為寡免疫復合物局灶節(jié)段壞死性腎小球腎炎(pauci-immune focal segmental necrotizing glomerulonephritis，PiFSGN)，可伴新月體

2、形成。在現(xiàn)有免疫抑制劑治療基礎上病情反復進展，最終發(fā)展至終末期腎衰竭。研究者發(fā)現(xiàn)針對B淋巴細胞的藥物治療仍有很高復發(fā)率，尤其PR3-ANCA(+)患者高達50％，說明其發(fā)病機制并沒完全弄清楚。因此，需更加深入地研究AAV的發(fā)病機理，以尋找更有效的治療方案。
　　單核細胞(Monocyte，Mo)來源于骨髓造血干細胞，浸潤于組織后可分化為巨噬細胞和樹突狀細胞，它參與病原微生物及內源性物質的吞噬、抗原提呈、T淋巴細胞功能調節(jié)等重要過程

3、，單核巨噬細胞具有強大吞噬功能，吞噬異常物質后可分泌促炎因子或抑炎因子，在維持機體穩(wěn)態(tài)扮演重要作用。研究表明單核細胞異常激活分泌大量炎癥介質參與多種疾病病理生理過程，包括AAV。在AAV節(jié)段壞死性腎小球腎炎早期階段以單核細胞浸潤為主，表明單核細胞異常激活可能在AAV腎損害扮演了啟動作用。
　　ANCA相關性血管炎最顯著血清學特征是患者血清可檢測出抗中性粒細胞胞漿抗體，它可激活中性粒細胞脫顆粒及產生活性氧，釋放中性粒細胞胞外誘捕網(

4、neutrophil extracellular traps，NETs)。NETs的形成釋放了胞漿自身抗原DNA、髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、蛋白水解酶3(Protease3，PR3)及抗微生物肽LL37(Cathelicidin LL37，LL37)等物質，這些自身抗原暴露于免疫監(jiān)視中誘導自身抗體形成及自身免疫性疾病。研究表明：異常形成的NETs參與多種自身免疫性疾病，包括誘發(fā)ANCA相關性血管炎。異常分泌

5、的炎癥介質一直被證實參與AAV病理損傷，如白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、干擾素α（interferon-α，IFN-α）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）等。但NETs對外周血單核細胞激活分泌炎癥介質的影響以及意義尚不完全清楚。
　　本實驗擬觀察NETs對單核細胞分泌炎癥介質IL-1β、IFN-α、TNF-α、IL-6、MCP-1、白細胞介素10(interleukin-10，IL

6、-10)、白細胞介素12(interleukin-12，IL-12)的影響，探討NETs對單核細胞活化的影響。
　　方法：
　　1、分別抽取6名健康志愿者（研究生同學）外周血各55ml，共后續(xù)實驗。
　　2、每人取5ml外周血，采用Polymorphprep分離液密度梯度離心法分離中性粒細胞，DAPI染色觀察細胞核形態(tài)，Beckman流式細胞儀檢測中性粒細胞提取純度。純化的中性粒細胞調整密度一致后分為對照組和PMA組兩

7、組，對照組采用等量PBS與中性粒細胞孵育，PMA組采用等量佛波脂（PMA，終濃度30ng/ml）與中性粒細胞孵育4h誘導NETs形成，吸棄含PMA的培養(yǎng)上清并洗棄殘留PMA后留存于培養(yǎng)板底的即為NETs，DAPI熒光染色，Leica激光共聚焦顯微鏡觀察NETs形成效率。
　　3、每人取50ml外周血，采用Ficoll密度梯度離心法分離單個核細胞，免疫磁珠法（StemCells人CD14正選試劑盒）從外周血單個核細胞分離提取單核細胞

8、，Beckman流式細胞儀檢測單核細胞提取純度。純化的單核細胞調整密度一致后分為對照組及NETs組，對照組采用等量細胞培養(yǎng)基與單核細胞培養(yǎng)體系，NETs組為等量上訴實驗誘導的培養(yǎng)板底部NETs與單核細胞共培養(yǎng)體系，孵育12小時后，收集培養(yǎng)上清存于-80℃冰箱。LEGENDplex人炎癥因子試劑盒檢測各組培養(yǎng)上清IL-1β、IFN-α、TNF-α、IL-6、MCP-1、IL-10、IL-12的濃度。
　　4、數(shù)據(jù)分析：數(shù)據(jù)以均值±標

9、準差表示，數(shù)據(jù)分析采用SPSS18.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學處理。兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1、Polymorphprep分離液密度梯度離心法分離提取健康志愿者外周血中性粒細胞，DAPI染色，細胞核呈分葉核，流式細胞儀鑒定純度為98％。純化的中性粒細胞分為對照組和PMA組兩組，孵育4小時后，DAPI染色行激光共聚焦顯微鏡觀察，對照組中性粒細胞核仍保持分葉核結構，而PMA組分

10、葉核結構破壞，可見絲狀DNA即NETs形成。
　　2、CD14正選試劑盒提取單核細胞純度為95.3％。
　　3、NETs對單核細胞分泌IL-1β的影響：NETs組與對照組IL-1β濃度分別為（97.60±60.11）pg/mL、＜1.17pg/mL，與對照組相比，NETs組單核細胞分泌IL-1β水平顯著升高(P＜0.05)。
　　4、NETs對單核細胞分泌IFN-α的影響：NETs組與對照組IFN-α濃度分別為（208

11、.90±77.38）pg/mL、＜1.17pg/mL，與對照組相比，NETs組單核細胞分泌IFN-α水平顯著升高(P＜0.01)。
　　5、NETs對單核細胞分泌TNF-α的影響：NETs組與對照組TNF-α濃度分別為（218.88±86.27）pg/mL、＜0.17pg/mL，與對照組相比，NETs組單核細胞分泌TNF-α的水平顯著升高(P＜0.01)。
　　6、NETs對單核細胞分泌MCP-1的影響：NETs組與對照組M

12、CP-1濃度分別為（1063.25±740.01）pg/mL、（157.16±3.86）pg/mL，與對照組相比，NETs組單核細胞分泌MCP-1水平顯著升高(P＜0.05)。
　　7、NETs對單核細胞分泌IL-6的影響：NETs組與對照組IL-6濃度分別為（67.76±15.51）pg/mL、（2.76±0.47）pg/mL，與對照組相比，NETs組單核細胞分泌IL-6的水平顯著升高(P＜0.01)。
　　8、NETs對

13、單核細胞分泌IL-10的影響：NETs組與對照組IL-10濃度分別為1.68±0.58pg/mL、＜1.15pg/mL，兩組IL-10水平無顯著差異。
　　9、NETs對單核細胞分泌IL-12的影響：NETs組與對照組IL-12濃度分別為＜1.30pg/mL、＜1.30pg/mL，兩組IL-12水平無顯著差異。
　　結論：
　　NETs能激活單核細胞，誘導IFN-α、IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1炎癥介質