LL37活化漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞在ANCA相關(guān)性血管炎中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體(anti-neutrophilcytoplasmicantibodies，ANCA)相關(guān)性血管炎(ANCAassociatedvasculitis，AAV)是一種自身免疫性小血管炎。約80％累及腎臟，可導(dǎo)致迅速進(jìn)展、不可逆的腎功能衰竭，預(yù)后兇險(xiǎn)。迫切要求更加深入地研究AAV的發(fā)病機(jī)理，以便提出更有效的治療策略。
　　機(jī)體對(duì)“自我”和“非我”的識(shí)別是免疫反應(yīng)的基礎(chǔ)，決定機(jī)體走向免疫耐受或激

2、活。在這一識(shí)別中，免疫細(xì)胞起關(guān)鍵作用。漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞(plasmacytoiddendriticcells，pDC)屬于樹(shù)突狀細(xì)胞(dendriticcells，DC)亞型，因其在病原體或其他炎性因素刺激下能夠產(chǎn)生大量Ⅰ型干擾素(interferontypeⅠ，IFN-α/β)，而又被稱為干擾素產(chǎn)生細(xì)胞。在天然免疫中，機(jī)體通過(guò)病原體相關(guān)分子模式(pathogenassociatedmolecularpattern，PAMP)及模式識(shí)

3、別受體(patternrecognitionreceptors，PPRs)區(qū)分“自我”和“非我”。近年來(lái)，pDC細(xì)胞因其特異性高表達(dá)PPRsToll樣受體7(Toll-likereceptor7，TLR7)和TLR9，而在自身免疫性疾病中的作用機(jī)制受到重視。尤其在銀屑病的發(fā)生中取得突破性研究進(jìn)展:發(fā)現(xiàn)pDC細(xì)胞可通過(guò)特異性表達(dá)的TLR7和TLR9，經(jīng)接頭分子髓樣分化因子88(myeloiddifferentiationfactor88，

4、MyD88)活化干擾素調(diào)節(jié)因子-7(interferonregulatoryfactor-7，IRF-7)介導(dǎo)的信號(hào)途徑，從而產(chǎn)生大量IFN-α，激活NK細(xì)胞和髓樣樹(shù)突狀細(xì)胞等天然免疫細(xì)胞，進(jìn)而活化自身免疫性Th1和Th17細(xì)胞，啟動(dòng)獲得性免疫應(yīng)答。
　　在正常情況下，pDC細(xì)胞對(duì)病原體DNA進(jìn)行識(shí)別引起免疫應(yīng)答，而對(duì)機(jī)體自身老化死亡細(xì)胞免疫忽視。這種對(duì)自身細(xì)胞的免疫耐受對(duì)維持生物體的完整性及內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定極其重要。然而，在自身免疫

5、性疾病中，內(nèi)源性IFN-α誘導(dǎo)物可替代病原體的DNA及RNA，打破免疫耐受，持續(xù)刺激pDC產(chǎn)生IFN-α，啟動(dòng)自身免疫應(yīng)答。研究發(fā)現(xiàn)，活動(dòng)期AAV患者血清IFN-α表達(dá)水平明顯增高，提示pDC活化導(dǎo)致IFN-α異常高表達(dá)參與了自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制。結(jié)合在銀屑病中抗菌肽LL37是導(dǎo)致pDC細(xì)胞異?；罨闹苯右蛩氐难芯孔C明，我們推測(cè):AAV患者體內(nèi)高表達(dá)的IFN-α可能與LL37有關(guān)。
　　抗微生物肽是機(jī)體天然免疫的重要組成部分。

6、LL-37作為目前人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的唯一一種Cathelicidin類抗微生物肽，已被證實(shí)可直接介導(dǎo)pDC細(xì)胞識(shí)別自身DNA，而參與自身免疫炎癥反應(yīng)。
　　中性粒細(xì)胞胞外捕網(wǎng)(neutrophilextracellulartraps，NETs)是中性粒細(xì)胞不同于凋亡、壞死的一種新的獨(dú)特的死亡方式，通過(guò)釋放大量自身DNA，導(dǎo)致機(jī)體自身DNA釋放，其過(guò)程命名為NETosis。NETs成分含有LL37，且腎組織有pDC細(xì)胞表達(dá)，根據(jù)LL37是

7、介導(dǎo)銀屑病pDC細(xì)胞識(shí)別自身DNA的作用推測(cè):ANCA誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞活化導(dǎo)致大量NETs產(chǎn)生，可能導(dǎo)致機(jī)體對(duì)自身DNA的異常識(shí)別，打破自身免疫耐受，從而參與ANCA相關(guān)小血管炎(AVV)的發(fā)病機(jī)制。LL37活化pDC細(xì)胞極可能在其中起關(guān)鍵作用。
　　本課題擬通過(guò)(1)檢測(cè)AAV患者血清及腎組織抗菌肽LL37及pDC細(xì)胞活化產(chǎn)物IFN-α的表達(dá)水平，結(jié)合臨床病例分析LL37及IFN-α表達(dá)與臨床血清學(xué)指標(biāo)及腎組織損傷程度的關(guān)系，以探

8、討LL37在AAV發(fā)病機(jī)制中的作用。(2)觀察體外分離純化的AAV患者外周血中性粒細(xì)胞NETs發(fā)生及LL37的表達(dá)，探討AAV患者體內(nèi)LL37是否通過(guò)NETs發(fā)生而釋放。(3)體外分離純化健康人外周血pDC細(xì)胞，觀察與AAV患者NETs共培養(yǎng)及分別予anti-LL37抗體或TLR9特異性拮抗劑ODN-TTAGG干預(yù)后pDC細(xì)胞活化、成熟標(biāo)志的表達(dá)及IFN-α的產(chǎn)生，明確AAV患者NETs是否通過(guò)LL37活化pDC細(xì)胞，探討LL37誘導(dǎo)p

9、DC細(xì)胞識(shí)別自身DNA的途徑及機(jī)制。綜合分析上述臨床病例、體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，探討抗微生物肽LL37活化pDC細(xì)胞在ANCA相關(guān)小血管炎中的機(jī)制，明確pDC細(xì)胞在整個(gè)發(fā)病過(guò)程中的作用，為進(jìn)一步探索通過(guò)阻斷pDC細(xì)胞對(duì)自身DNA的免疫應(yīng)答途徑治療AVV的新策略奠定基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　第一部分AAV患者血清及腎組織LL37及IFN-α的表達(dá)及意義
　　1.收集AAV患者及健康志愿者外周靜脈血血清標(biāo)本，采用ELIS

10、A檢測(cè)血清LL37及IFN-α水平，了解AAV患者體內(nèi)LL37及IFN-α水平與健康人群的差異。
　　2.回顧性分析AAV患者臨床病歷資料，采用2×2列聯(lián)表分析、相關(guān)分析、獨(dú)立樣本K-S檢驗(yàn)、兩獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)曼-惠特尼U檢驗(yàn)，評(píng)價(jià)LL37及IFN-α表達(dá)與腎功能損害及腎組織新月體形成的關(guān)系。
　　3.收集AAV患者腎組織活檢病理標(biāo)本，通過(guò)免疫熒光染色及激光共聚焦方法檢測(cè)腎組織LL37、IFN-α及pDC細(xì)胞特異性表面標(biāo)志

11、血樹(shù)突狀細(xì)胞抗原(blooddendriticcellantigen2，BDCA2)的表達(dá)，了解局部腎臟炎癥部位是否存在LL37及IFN-α的表達(dá)及pDC細(xì)胞的募集。
　　第二部分AAV患者NETs的產(chǎn)生及LL37釋放
　　1.收集AAV患者及健康志愿者新鮮外周靜脈血標(biāo)本，采用PolymorphprepTM密度梯度離心法分離中性粒細(xì)胞并進(jìn)行體外培養(yǎng)。
　　2.采用免疫熒光染色及激光共聚焦、掃描電鏡觀察AAV患者及健康志

12、愿者外周血中性粒細(xì)胞NETs的產(chǎn)生。
　　3.免疫熒光觀察AAV患者及健康志愿者外周血中性粒細(xì)胞NETs的產(chǎn)生情況及是否存在LL37的釋放。
　　4.ELISA檢測(cè)中性粒細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LL37的水平。
　　5.免疫熒光檢測(cè)AAV患者腎組織NETs組分如組蛋白、自身抗原溶酶體膜蛋白-2(lysosomalmembraneprotein-2，LAMP-2)、髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、蛋白水解

13、酶3(protease3，PR3)，的表達(dá)，了解腎臟炎癥損傷局部募集的中性粒細(xì)胞是否存在NETs組分。
　　第三部分AAV患者LL37活化pDC細(xì)胞機(jī)制
　　1.收集AAV患者及健康志愿者新鮮外周靜脈血標(biāo)本，采用PolymorphprepTM密度梯度離心法分離中性粒細(xì)胞，收集體外培養(yǎng)的中性粒細(xì)胞上清液。
　　2.采用免疫磁珠技術(shù)分選健康人外周血pDC細(xì)胞，并通過(guò)流式活細(xì)胞分選技術(shù)進(jìn)一步提純，得到CD4+CD11c-Li

14、neage-pDC細(xì)胞。
　　3.AAV患者或健康志愿者中性粒細(xì)胞NETs上清液與pDC細(xì)胞共培養(yǎng)，流式分析檢測(cè)pDC細(xì)胞的活化、成熟標(biāo)志，觀察AAV患者NETs是否可促進(jìn)pDC細(xì)胞的活化、成熟。
　　4.分別予anti-LL37抗體或TLR9特異性拮抗劑ODN-TTAGG干預(yù)后，流式分析檢測(cè)與AAV患者及健康志愿者NETs上清液共培養(yǎng)的pDC細(xì)胞的活化、成熟標(biāo)志。探討AAV患者NETs是否通過(guò)LL37活化pDC細(xì)胞，以及L

15、L37活化pDC細(xì)胞是否通過(guò)TLR9途徑實(shí)現(xiàn)。
　　5.收集與NETs共培養(yǎng)的各組pDC細(xì)胞上清液，ELISA檢測(cè)IFN-α的表達(dá)，明確AAV患者NETs是否通過(guò)促進(jìn)pDC細(xì)胞產(chǎn)生IFN-α而參與免疫應(yīng)答。
　　結(jié)果：
　　第一部分
　　1.AAV患者血清LL37及IFN-α水平較健康志愿者明顯升高(LL37:U=829.00，P＜0.001;IFN-α:U=1438.00，P＜0.001)，合并新月體腎炎的AA

16、V患者血清LL37及IFN-α水平較無(wú)新月體腎炎AAV患者明顯增高(LL37:P＜0.01;IFN-α:P＜0.001)。
　　2.高表達(dá)LL37及IFN-α的AAV患者較低表達(dá)患者合并新月體腎炎的比例更高(LL37:x2=9.724，P=0.002;IFN-α:x2=16.835，P=0.000)。
　　3.AAV患者血清LL37與IFN-α表達(dá)水平成正相關(guān)限=0.577，P=0.000);且LL37及IFN-α表達(dá)水平均

17、與AAV患者血肌酐水平成正相關(guān)(LL37:R=0.437，P=0.000;IFN-α:(R=0.337，P=0.004))，與補(bǔ)體C3水平無(wú)明顯相關(guān)性(LL37:R=0.020，P=0.871;IFN-α:R=-0.12,P=0.922)。
　　4.新月體陽(yáng)性AAV患者腎臟局部炎癥組織有LL37及IFN-α高表達(dá)，而新月體陰性AAV患者腎組織僅有少量LL37及IFN-α表達(dá)。
　　第二部分
　　1.AAV患者外周血中性

18、粒細(xì)胞有大量NETs形成，較健康對(duì)照組明顯增多(P＜0.001)。
　　2.AAV患者外周血中性粒細(xì)胞NETs形成釋放抗菌肽LL37及ANCA靶抗原LAMP-2、MPO、PR3。
　　3.合并新月體腎炎的AAV患者腎組織炎癥損傷局部有NETs形成，并有抗菌肽LL37與ANCA靶抗原LAMP-2、MPO、PR3表達(dá)。
　　4.合并新月體腎炎的AAV患者腎組織炎癥損傷局部抗菌肽LL37與NETs其他組分如組蛋白、MPO共表

19、達(dá)。
　　第三部分
　　1.與AAV患者外周血中性粒細(xì)胞NETs上清液共培養(yǎng)的健康人外周血pDC細(xì)胞表面活化標(biāo)志CD80及成熟標(biāo)志CD83的表達(dá)較健康志愿者中性粒細(xì)胞組明顯增高(CD80:P＜0.01;CD83:P＜0.01)。
　　2.Anti-LL37抗體干預(yù)后，與AAV患者NETs上清液共培養(yǎng)的pDC細(xì)胞表面標(biāo)志CD80及CD83表達(dá)較干預(yù)前明顯下降(CD80:P＜0.05;CD83:P＜0.01)。
　　

20、3.ODN-TTAGG干預(yù)后，與AAV患者NETs上清液共培養(yǎng)的pDC細(xì)胞表面標(biāo)志CD80及CD83表達(dá)較干預(yù)前明顯下降。(CD80:P＜0.01;CD83:P＜0.01)
　　4.與AAV患者外周血中性粒細(xì)胞NETs上清液共培養(yǎng)的健康人外周血pDC細(xì)胞上清液IFN-α表達(dá)較健康志愿者中性粒細(xì)胞組明顯增高(P＜0.001)。
　　5.予Anti-LL37抗體或ODN-TTAGG干預(yù)后，與AAV患者NETs上清液共培養(yǎng)的pDC

21、細(xì)胞上清液IFN-α表達(dá)較干預(yù)前明顯下降(Anti-LL37:P＜0.001;ODN-TTAGG:P＜0.001)。
　　結(jié)論：
　　1.AAV患者尤其是合并新月體腎炎的患者，血清LL37及IFN-α水平明顯升高。新月體腎炎患者腎臟局部炎癥組織有LL37及IFN-α表達(dá)。
　　2.AAV患者血清LL37與IFN-α水平成正相關(guān)，LL37及IFN-α水平與AAV患者血肌酐水平成正相關(guān)，且高表達(dá)LL37與IFN-α的AAV

22、患者更易合并新月體腎炎。
　　3.AAV患者外周血中性粒細(xì)胞有大量NETs形成。
　　4.AAV患者外周血中性粒細(xì)胞NETs形成可釋放抗菌肽LL37及ANCA靶抗原LAMP-2、MPO、PR3。
　　5.AAV患者外周血中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的NETs可刺激體外分離的健康人外周血pDC細(xì)胞活化、成熟并產(chǎn)生IFN-α。
　　6.拮抗LL37或TLR9功能后，AAV患者NETs刺激pDC細(xì)胞活化、成熟及IFN-α產(chǎn)生能力明顯