補體C3對巨噬細(xì)胞本身自噬及其自噬弓形蟲的影響和機制初探.pdf

1、自噬對細(xì)胞生存、生長及維持自身穩(wěn)態(tài)是十分重要的。自噬不但是細(xì)胞自身防御和應(yīng)激的調(diào)控機制，而且與固有免疫及適應(yīng)性免疫有著密切聯(lián)系，并且外源病原體感染可以誘發(fā)細(xì)胞發(fā)生自噬。目前已證實，自噬與TLR、NLR、RLR等固有免疫組成部分都有密切的相互作用關(guān)系。補體系統(tǒng)作為固有免疫的重要組成部分能夠通過經(jīng)典途徑、凝集素途徑及旁路途徑被激活。這三條途徑均導(dǎo)致C3被活化，并產(chǎn)生活性片段C3a和C5a，進而形成C5-C9攻膜復(fù)合物。C3a和C5a都能通過

2、分別與C3aR和C5aR結(jié)合來誘導(dǎo)產(chǎn)生炎性因子。然而補體與自噬之間的關(guān)系尚未見報道。本課題首先利用表達EGFP的熒光弓形蟲及C3-/-C57 BL6/J小鼠構(gòu)建了弓形蟲入侵小鼠腹腔巨噬細(xì)胞發(fā)生自噬的實驗平臺，利用Western、激光共聚焦及透射電子顯微鏡等實驗手段觀察對比C3-/-組與對照組自噬水平的變化差異，用流式細(xì)胞術(shù)及激光共聚焦的方法來觀察宿主細(xì)胞自噬對巨噬細(xì)胞殺傷弓形蟲能力的影響。結(jié)果顯示，局部補體C3不僅能夠抑制巨噬細(xì)胞自身的

3、經(jīng)典自噬水平還能抑制巨噬細(xì)胞自噬弓形蟲的水平，并且補體C3對宿主細(xì)胞自噬水平的抑制能夠抑制IFN-γ清除弓形蟲。然后我們還對C3負(fù)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞自噬的機制進行了初步探討。這一現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)豐富了我們對自噬與固有免疫之間關(guān)系的認(rèn)識，并十分有利于我們深入理解自噬相關(guān)疾病的發(fā)病機制。
　　一、局部產(chǎn)生的補體C3抑制巨噬細(xì)胞的經(jīng)典自噬及選擇性自噬
　　1.局部產(chǎn)生的補體C3抑制巨噬細(xì)胞的經(jīng)典自噬:收集HBSS培養(yǎng)巨噬細(xì)胞0h、3h、6h、

4、12h、24h的蛋白，通過Western檢測自噬標(biāo)志蛋白LC3及LAMP-1的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)C3-/-組LC3Ⅱ/Ⅰ及LAMP-1的水平明顯高于對照組。
　　2.局部補體C3能抑制巨噬細(xì)胞自噬弓形蟲:弓形蟲入侵巨噬細(xì)胞不同時間點分別利用激光共聚焦觀察統(tǒng)計LC3及LAMP-1與被巨噬細(xì)胞自噬的弓形蟲的共聚率及熒光強度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)C3-/-。組明顯高于對照組，Western檢測LC3、LAMP-1及P62蛋白表達量，結(jié)果顯示C3-/

5、-細(xì)胞中LAMP-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ明顯高于WT，而P62則低于WT。
　　3.局部產(chǎn)生的補體C3通過抑制自噬而抑制IFN-γ清除弓形蟲:激光共聚焦及流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果分析得出，在C3-/-細(xì)胞中弓形蟲的感染率和平均蟲數(shù)都低于WT細(xì)胞。共聚焦結(jié)果顯示自噬促進劑Rapamycin和自噬抑制劑3-MA分別能增強和抑制LC3和LAMP-1與弓形蟲的共聚，這說明mTOR和PI3k信號通路影響了巨噬細(xì)胞的特異性自噬。并且自噬抑制劑wortm

6、annin能夠逆轉(zhuǎn)C3抑制IFN-γ殺傷胞內(nèi)弓形蟲的作用，這一結(jié)果說明局部產(chǎn)生的C3是通過抑制自噬來發(fā)揮抑制IFN-γ清除弓形蟲的作用的。
　　二、補體C3影響巨噬細(xì)胞自噬水平的機制初步探討
　　1.被弓形蟲速殖子入侵的巨噬細(xì)胞中補體活化并產(chǎn)生C3a: ELISA方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)基上清中補體C3a的表達水平，對照組細(xì)胞隨時間延長C3a表達水平逐漸升高，C3-/-組中的C3a表達水平幾乎為零。
　　2.C5a/C5aR信