弓形蟲(chóng)IMP1蛋白缺失及細(xì)胞自噬對(duì)弓形蟲(chóng)胞內(nèi)增殖的作用.pdf

1、弓形蟲(chóng)是呈世界范圍傳播的胞內(nèi)寄生性原蟲(chóng)，能感染包括人類在內(nèi)的幾乎所有的溫血?jiǎng)游?，其引起的弓形蟲(chóng)病在免疫缺陷、抑制個(gè)體中是致命性的，目前還無(wú)有效的治療藥物，因此研發(fā)安全且切實(shí)有效的疫苗一直是該病防治的關(guān)鍵。近年發(fā)現(xiàn)的弓形蟲(chóng)免疫作圖蛋白1(Immune mapped protein1，IMP1)定位于蟲(chóng)體表膜且具有較強(qiáng)的免疫原性，可作為疫苗候選分子，本研究通過(guò)同源重組基因敲除、間接免疫熒光、免疫印跡等技術(shù)對(duì)imp1基因功能進(jìn)行研究，探討im

2、p1基因與弓形蟲(chóng)腦內(nèi)增殖及與細(xì)胞自噬的作用，為弓形蟲(chóng)病防控奠定理論基礎(chǔ)。
　　1.弓形蟲(chóng)imp1基因敲除載體及回補(bǔ)載體的構(gòu)建
　　為研究弓形蟲(chóng)imp1基因的功能，本研究擬通過(guò)構(gòu)建同源重組敲除質(zhì)粒及回補(bǔ)質(zhì)粒，篩選基因敲除及回補(bǔ)蟲(chóng)株。以弓形蟲(chóng)Δku80RH株基因組DNA及cDNA為模板，設(shè)計(jì)特異性引物，PCR擴(kuò)增imp15'UTR、imp13'UTR、imp1CDS及sag1啟動(dòng)子區(qū)，其中imp1CDS和sag1啟動(dòng)子序列通過(guò)融

3、合PCR進(jìn)行連接。以pBSK(+)質(zhì)粒為骨架，利用限制性內(nèi)切酶插入imp15'UTR、imp13'UTR和ble藥物基因，構(gòu)建成基因敲除質(zhì)粒pBSK-imp15'UTR-ble-imp13'UTR;此外，以pTCY質(zhì)粒為骨架，利用限制性內(nèi)切酶插入imp15'UTR、imp13'UTR和Psag1-imp1CDS序列，構(gòu)建成回補(bǔ)質(zhì)粒pTCY-imp15'UTR-CAT-Psag1-imp1CDS-imp13'UTR。結(jié)果表明通過(guò)分子生物學(xué)

4、技術(shù)成功構(gòu)建了imp1基因敲除質(zhì)粒和回補(bǔ)質(zhì)粒。
　　2.弓形蟲(chóng)imp1基因缺失株及回補(bǔ)株的篩選、鑒定及生物學(xué)功能研究
　　通過(guò)同源重組的方法，將弓形蟲(chóng)imp1基因進(jìn)行替換并經(jīng)過(guò)藥物篩選獲得基因缺失株，并在基因缺失株基礎(chǔ)上篩選回補(bǔ)株，并通過(guò)PCR、western blot和間接免疫熒光等技術(shù)對(duì)缺失株及回補(bǔ)株進(jìn)行鑒定;將野生型、缺失株及回補(bǔ)株三種蟲(chóng)株感染Vero細(xì)胞，并在不同時(shí)間點(diǎn)收集樣品，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡對(duì)三種蟲(chóng)株的黏附、

5、入侵速殖子數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)分析，同時(shí)對(duì)這三者的胞內(nèi)增殖通過(guò)絕對(duì)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行分析;另外，將三種蟲(chóng)株接種ICR小鼠，通過(guò)記錄各組小鼠的存活情況及對(duì)各組小鼠的肺、肝、脾組織中的蟲(chóng)荷數(shù)進(jìn)行分析。結(jié)果表明缺失株在黏附試驗(yàn)的各時(shí)間點(diǎn)(15min、30min、45min、1h、2h、4h)統(tǒng)計(jì)到的速殖子個(gè)數(shù)均顯著少于野生型及回補(bǔ)蟲(chóng)株，與野生型相比分別降低了70.6％、68.0％、60.0％、53.6％、53.2％和48.7％，入侵試驗(yàn)中(45m

6、in、1h、2h、4h)缺失株的速殖子個(gè)數(shù)也分別降低了58.2％、51.1％和46.3％，而胞內(nèi)增殖(24h、48h、72h)也分別降低了70.7％、65.0％和47.0％;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，接種野生型及回補(bǔ)蟲(chóng)株的小鼠都在感染后9天內(nèi)死亡，而接種缺失株的小鼠平均存活時(shí)間為26.8±2.6天，顯著高于野生型及回補(bǔ)蟲(chóng)株，在肺、肝、脾組織檢測(cè)到的蟲(chóng)荷數(shù)也顯著低于野生型及回補(bǔ)蟲(chóng)株接種的小鼠。
　　3.弓形蟲(chóng)感染引起細(xì)胞自噬
　　為探索弓形

7、蟲(chóng)胞內(nèi)增殖與細(xì)胞自噬的關(guān)系，將弓形蟲(chóng)感染Vero細(xì)胞，通過(guò)透射電子顯微鏡、激光共聚焦、免疫印跡、絕對(duì)熒光定量PCR等技術(shù)手段，證明了弓形蟲(chóng)感染能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬，結(jié)果表明，弓形蟲(chóng)感染誘導(dǎo)細(xì)胞自噬小體的形成并且觀察到少量的自噬溶酶體，間接免疫熒光也觀察到細(xì)胞內(nèi)LC3聚集在弓形蟲(chóng)的周?chē)?，LC3與溶酶體也存在一定比例的共定位現(xiàn)象，免疫印跡結(jié)果則證實(shí)了弓形蟲(chóng)感染細(xì)胞后LC3-Ⅱ比例的顯著增加，說(shuō)明弓形蟲(chóng)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生了自噬。對(duì)細(xì)胞分別使用自噬抑制

8、劑3-MA和促進(jìn)劑雷帕霉素處理后檢測(cè)弓形蟲(chóng)的胞內(nèi)增殖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自噬抑制組對(duì)弓形蟲(chóng)胞內(nèi)增殖水平顯著性地低于自噬促進(jìn)組，說(shuō)明細(xì)胞自噬的狀態(tài)與弓形蟲(chóng)的胞內(nèi)增殖水平密切相關(guān)。研究結(jié)果為進(jìn)一步探索弓形蟲(chóng)感染過(guò)程中細(xì)胞自噬對(duì)弓形蟲(chóng)的增殖及致病作用的影響奠定了基礎(chǔ)。
　　4.弓形蟲(chóng)感染引起細(xì)胞自噬的信號(hào)通路
　　為探究弓形蟲(chóng)感染誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬的信號(hào)通路，本研究通過(guò)免疫印跡檢測(cè)了誘導(dǎo)自噬的幾條經(jīng)典通路中多種組分的蛋白及其磷酸化水平，結(jié)

9、果發(fā)現(xiàn)Raf1-MEK-ERK通路中的Raf1和ERK1/2蛋白及其磷酸化水平均顯著高于對(duì)照組，相對(duì)熒光定量結(jié)果也表明了Raf1、MEK、ERK1/2的RNA水平也顯著高于對(duì)照組;對(duì)細(xì)胞分別使用ERK1/2抑制劑FR180204、Raf1抑制劑sorafenib、MEK抑制劑UO126-EtoH進(jìn)行預(yù)處理再感染弓形蟲(chóng)進(jìn)行蛋白分析，結(jié)果表明各抑制劑處理后相應(yīng)地蛋白表達(dá)均發(fā)生了不同程度的下降但都顯著低于無(wú)處理對(duì)照組，而移除抑制劑并接種弓形蟲(chóng)

10、后檢測(cè)到Raf1-MEK-ERK通路的各組分蛋白均得到了不同程度的回升。對(duì)各抑制劑組的弓形蟲(chóng)胞內(nèi)增殖進(jìn)行絕對(duì)銀光定量分析，結(jié)果表明除MEK抑制劑UO126-EtoH處理組外，其余均顯著低于對(duì)照組;而對(duì)弓形蟲(chóng)imp1、rop18、gra7增殖相關(guān)基因的mRNA水平分析，結(jié)果表明，各抑制劑組中imp1、rop18的mRNA水平有不同程度的下降，而gra7有一定程度的上升，以上結(jié)果表明弓形蟲(chóng)感染誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬是通過(guò)Raf1-MEK-ERK通

11、路進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并且對(duì)該通路進(jìn)行抑制后弓形蟲(chóng)的胞內(nèi)增殖水平有所降低，增殖相關(guān)基因mRNA水平也有一定的降低。
　　5.弓形蟲(chóng)IMP1蛋白與細(xì)胞自噬的互作
　　弓形蟲(chóng)IMP1蛋白具有很強(qiáng)的免疫原性，IMP1亞單位疫苗能提供較好的抗弓形蟲(chóng)保護(hù)力。為研究IMP1蛋白與細(xì)胞自噬的關(guān)系，構(gòu)建了pcDNA-pSAG1-IMP1真核表達(dá)載體并將之轉(zhuǎn)染進(jìn)Vero細(xì)胞，通過(guò)免疫印跡檢測(cè)IMP1的表達(dá)確認(rèn)轉(zhuǎn)染成功，隨后對(duì)檢測(cè)自噬相關(guān)通路的蛋白及

12、磷酸化水平，初步確認(rèn)IMP1蛋白通過(guò)Raf1-MEK-ERK和AMPK-TSC2-mTOR通路誘導(dǎo)細(xì)胞自噬;通過(guò)免疫共沉淀技術(shù)，確認(rèn)IMP1與Raf1-MEK-ERK通路的是間接互作。該發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究弓形蟲(chóng)與Raf1-MEK-ERK通路的互作奠定了一定的基礎(chǔ)。
　　綜上，通過(guò)基因工程技術(shù)獲得了弓形蟲(chóng)Δku80Δimp1RH蟲(chóng)株，對(duì)缺失株進(jìn)行生物學(xué)特性研究，發(fā)現(xiàn)缺失imp1基因后弓形蟲(chóng)的粘附、入侵和胞內(nèi)增殖能力顯著降低，體內(nèi)攻毒試