弓形蟲ROP18蛋白對宿主細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、目的：研究弓形蟲棒狀體蛋白ROP18是否與弓形蟲抑制宿主細(xì)胞的凋亡有關(guān)。
　　方法:利用軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增ROP18基因的引物，在ROP18基因上游引入Flag標(biāo)簽序列，為方便下游克隆，在上游及下游引物的5’端分別引入BamHⅠ及HindⅢ酶切位點(diǎn)。酚-氯仿法提取弓形蟲RH株基因組DNA，以其為模板PCR擴(kuò)增ROP18基因。利用試劑盒純化PCR產(chǎn)物，利用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切克隆到pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體的相同位點(diǎn)，構(gòu)建

2、pcDNA3.1(+)-Flag-ROP18真核表達(dá)載體,DNA序列分析鑒定正確后,大量提取質(zhì)粒,利用試劑盒去除內(nèi)毒素，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞表達(dá)。分離蛋白，SDS-PAGE及利用Flag標(biāo)簽抗體進(jìn)行Western blotting檢測ROP18在RAW264.7細(xì)胞中的表達(dá)。H2O2分別誘導(dǎo)不含重組質(zhì)粒的RAW264.7細(xì)胞（對照組）、含重組質(zhì)粒的RAW264.7細(xì)胞（轉(zhuǎn)染組）發(fā)生凋亡，于24h、48h分別檢測以下凋亡指標(biāo)：

3、細(xì)胞爬片經(jīng)HE染色后顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，觀察細(xì)胞是否表現(xiàn)凋亡的特征性形態(tài)變化；分離線粒體及細(xì)胞漿進(jìn)行Western blotting檢測細(xì)胞色素c在線粒體與胞漿中的分布，確定細(xì)胞色素C是否從線粒體釋放到胞漿；提取細(xì)胞基因組DNA進(jìn)行瓊脂糖電泳EB染色后檢測DNA是否發(fā)生了凋亡特征性的梯狀片斷化。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷弓形蟲ROP18蛋白對H2O2誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞凋亡是否具有抑制作用。
　　結(jié)果：
　　DNA序

4、列分析結(jié)果顯示正確構(gòu)建了pcDNA3.1(+)-Flag-ROP18真核表達(dá)載體，Western blotting檢測到ROP18在RAW264.7細(xì)胞中的表達(dá)。H2O2誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染組和對照組RAW264.7細(xì)胞凋亡的結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染組與對照組RAW264.7細(xì)胞形態(tài)均出現(xiàn)明顯的凋亡特征：細(xì)胞變圓，細(xì)胞膜皺縮，染色質(zhì)濃縮；Western blotting檢測到細(xì)胞色素c在線粒體與胞漿中均有分布，說明細(xì)胞色素c從線粒體轉(zhuǎn)移至胞漿；DNA出現(xiàn)片斷