弓形蟲ROP16的表達(dá)及其調(diào)控宿主細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、目的：
　　將弓形蟲棒狀體16蛋白在體外表達(dá)并將其純化后，制備兔抗多克隆抗體。構(gòu)建ROP16真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞，使其成功表達(dá)ROP16蛋白，探討ROP16對(duì)293T細(xì)胞凋亡的影響。
　　方法：
　　分別構(gòu)建重組質(zhì)粒ROP16/pTG19-T和ROP16/pET32a，并于Rosetta中誘導(dǎo)表達(dá)。通過(guò)KCl染色切膠法對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化，制備多克隆抗體，并用Western blotting和IFA技術(shù)分別對(duì)

2、其進(jìn)行鑒定。
　　構(gòu)建ROP16真核表達(dá)重組質(zhì)粒p3XFLAG-Myc-CMV?-24-ROP16，并用PCR和雙酶切法進(jìn)行鑒定，提取無(wú)內(nèi)毒素陽(yáng)性質(zhì)粒。采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法使得重組蛋白在293T細(xì)胞中表達(dá)，在三個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)收集標(biāo)本，用Wenstern blotting和RT-PCR法檢測(cè)分別定量和定性檢測(cè)ROP16在293T細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。
　　將293T細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至60％左右（≤24h），向細(xì)胞中轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒和p

3、3XFLAG-Myc-CMV?-24-ROP16重組質(zhì)粒。使用0.5μg/ml Act D誘導(dǎo)凋亡。于轉(zhuǎn)染后24 h、48 h收集標(biāo)本，分別用于以下實(shí)驗(yàn)：將標(biāo)本用Annexin V-FITC/PI染色以及TUNEL BrightGreen試劑盒染色，檢測(cè)凋亡率。提取標(biāo)本中RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-PCR法檢測(cè)Bcl-2/Bax及Caspase3的變化。
　　結(jié)果：
　　成功擴(kuò)增出ROP16基因片段并構(gòu)建ROP16原核表

4、達(dá)重組質(zhì)粒。電泳結(jié)果顯示99.8 kDa處有符合大小的條帶。將純化后重組蛋白免疫家兔并獲得多克隆抗體。Western blotting結(jié)果顯示在74 kDa處有符合大小條帶，IFA結(jié)果顯示目的蛋白的綠色熒光分布在弓形蟲速殖子的胞質(zhì)內(nèi)，具體位置為細(xì)胞核前端。
　　成功構(gòu)建真核表達(dá)重組載體p3XFLAG-Myc-CMV?-24-ROP16，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣本經(jīng)Western blotting均能檢測(cè)出符合大小的條帶，根

5、據(jù)條帶的粗細(xì)判斷蛋白表達(dá)量與時(shí)間成正比。
　　數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染ROP16的實(shí)驗(yàn)組凋亡率均低于對(duì)照組，并且在24h、48h兩組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。轉(zhuǎn)染后24 h、48 h，ROP16轉(zhuǎn)染組Bcl-2/Bax明顯高于空載轉(zhuǎn)染組（P＜0.05）。ROP16轉(zhuǎn)染組Caspase3與actin比值明顯低于空載轉(zhuǎn)染組（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　成功構(gòu)建了原核表達(dá)重組質(zhì)粒ROP16/pET32a，并制備R