弓形蟲LAMP檢測方法的建立與ROP18的免疫保護(hù)作用.pdf

1、弓形蟲病(Toxoplasmosis)是由剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)寄生于人和多種動物有核細(xì)胞內(nèi)所引起的人獸共患原蟲病,該病廣泛流行于世界各地。弓形蟲不僅對人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅,還給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。目前,弓形蟲病的診斷主要采取病原學(xué)和免疫學(xué)方法,但病原學(xué)方法檢出率低,免疫學(xué)方法敏感性、特異性尚不夠理想。因此,建立敏感性高、特異性強(qiáng)、且操作簡便的弓形蟲快速診斷方法對于弓形蟲病的防控具有重要意義。鑒于弓形蟲

2、病的治療目前主要依賴磺胺類藥物,其耐藥性的產(chǎn)生及藥物殘留對人體健康的危害日益受到關(guān)注,對弓形蟲蟲體蛋白的免疫保護(hù)力進(jìn)行研究,可為研制弓形蟲疫苗篩選候選抗原提供依據(jù),弓形蟲棒狀體蛋白18(ROP18)已被證實是一種重要的毒力因子,參與弓形蟲入侵宿主細(xì)胞且介導(dǎo)弓形蟲的免疫逃避,已有學(xué)者對弓形蟲ROP18蛋白進(jìn)行克隆表達(dá)和反應(yīng)原性分析,但是目前關(guān)于其免疫保護(hù)力的研究報道相對較少。
　　本研究首先通過對安徽豬源弓形蟲529bp基因序列進(jìn)行

3、PCR擴(kuò)增、克隆、測序和分析,獲得保守區(qū)域;接著運用環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(LAMP)在線引物設(shè)計軟件Primer Explorer 4.0設(shè)計LAMP擴(kuò)增引物,并使用Oligo6.0和PrimerPremier5軟件進(jìn)行綜合分析和篩選;然后以pMD-19T-529bp重組質(zhì)粒為模板,建立LAMP擴(kuò)增反應(yīng),并對擴(kuò)增反應(yīng)體系和條件進(jìn)行優(yōu)化;最后對所建立LAMP方法的敏感性和特異性進(jìn)行評定,并與PCR方法相比較。結(jié)果:擴(kuò)增出安徽豬源弓形蟲529bp

4、基因序列,發(fā)現(xiàn)其主要突變區(qū)域在第31~74位和第100~141位堿基;設(shè)計出一套弓形蟲529bp基因LAMP擴(kuò)增引物;建立了弓形蟲LAMP檢測方法,經(jīng)過優(yōu)化確定了該方法的最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件,且通過添加環(huán)引物使得反應(yīng)時間縮短為33min,該檢測方法與超純水,豬、隱孢子蟲、球蟲基因組DNA無交叉反應(yīng),特異性較好;敏感性較高,達(dá)1.0×103copies/mL,是PCR方法的10倍。
　　本研究還對弓形蟲RH株的ROP18基因進(jìn)行了

5、PCR擴(kuò)增、克隆和測序鑒定,然后分別構(gòu)建了弓形蟲ROP18原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-ROP18和真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-ROP18-Flag,并分別在E.coilRosseta和BHK-21細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá);原核表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定,并對誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化和重組蛋白的表達(dá)形式進(jìn)行分析;運用Ni-NTA柱對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化;經(jīng)Western-blot檢測重組蛋白的反應(yīng)原性;分別采用間接免疫熒光試驗和Western-bl

6、ot進(jìn)行真核表達(dá)產(chǎn)物和產(chǎn)物的反應(yīng)原性鑒定;分別使用重組質(zhì)粒和經(jīng)佐劑乳化的重組蛋白免疫昆明小白鼠,同時設(shè)立空白對照組和PBS對照組,并于3免后運用間接ELISA法測定小白鼠血清中抗弓形蟲抗體效價;3免后10d對小白鼠進(jìn)行攻蟲試驗:腹腔接種3000個弓形蟲速殖子,觀察小鼠存活時間,從而研究ROP18對小白鼠的抗弓形蟲免疫保護(hù)力。結(jié)果:構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-ROP18和真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-ROP18-Flag;原核表達(dá)質(zhì)

7、粒在E.coil Rosseta中以包涵體形式表達(dá),經(jīng)純化后得到濃度為2.3mg/mL重組蛋白,符合免疫要求;真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-ROP18-Flag在BHK-21細(xì)胞中成功表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)間接免疫熒光試驗顯示出特異性的綠色熒光;Western-blot結(jié)果表明兩種表達(dá)方式的表達(dá)產(chǎn)物均具有良好的反應(yīng)原性;間接ELISA法測得重組質(zhì)粒和重組蛋白均可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗弓形蟲抗體,其中重組質(zhì)粒組平均效價為1:15360,重組蛋白組平均效