弓形蟲SAG1和ROP18DNA疫苗誘導(dǎo)小鼠保護(hù)性換疫的研究.pdf

1、目的:
　　分別構(gòu)建剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）表面抗原1(surface antigen1，SAG1)及棒狀體蛋白18（rhoptry protein18，ROP18）的真核表達(dá)質(zhì)粒，并在真核細(xì)胞293T中表達(dá)目的蛋白。觀察弓形蟲SAG1、ROP18單基因疫苗及聯(lián)合疫苗誘導(dǎo)BALB/c小鼠的保護(hù)性免疫作用。
　　方法:
　　設(shè)計(jì)弓形蟲SAG1、ROP18的特異引物，用RCR技術(shù)從弓形蟲RH株cDN

2、A中擴(kuò)增編碼SAG1、ROP18基因片段，經(jīng)克隆至pTG19-T載體后，亞克隆至真核表達(dá)載體p3×FLAG-Myc-CMVTM-24，構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-SAG1和p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-ROP18。
　　將構(gòu)建好的真核表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人腎上皮細(xì)胞系293T細(xì)胞，RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡技術(shù)(Western blotting)分析轉(zhuǎn)染細(xì)胞的目的蛋白表達(dá)情況。
　　大

3、量制備重組真核表達(dá)質(zhì)粒p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-SAG1，p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-ROP18及對(duì)照質(zhì)粒p3×FLAG-Myc-CMVTM-24，用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋至1μg/μL。將102只BALB/c小鼠隨機(jī)分成六組，第1組為PBS對(duì)照組（PBS組），每次注射100μL;第2組為空載體p3×FLAG-Myc-CMVTM-24對(duì)照組（空載體組），每次注射100μL;第3組為p3×FLAG-Myc

4、-CMVTM-24-SAG1（SAG1組），每次注射100μL;第4組為p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-ROP18（ROP18組），每次注射100μL;第5組為p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-SAG1和p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-ROP18混合組（全量混合組），每次分別注射100μL;第6組為p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-SAG1和p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-ROP18混合組（

5、半量混合組），每次分別注射50μL。每?jī)芍苊庖咭淮危裁庖?次。末次免疫后四周，各組隨機(jī)取7只小鼠，無(wú)菌取脾，流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠脾臟CD4+T、CD8+T細(xì)胞群，Real-time PCR檢測(cè)各組小鼠脾臟細(xì)胞因子IL-4、IL-12和IFN-γ。每組剩余10只小鼠經(jīng)腹腔接種1×103個(gè)弓形蟲速殖子，觀察小鼠的生存時(shí)間。
　　結(jié)果:
　　PCR擴(kuò)增弓形蟲SAG1和ROP18基因片段大小分別為1011bp和1665bp，與預(yù)期大

6、小相符。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、酶切和測(cè)序鑒定結(jié)果均正確。
　　通過RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡技術(shù)鑒定出重組p3×FLAG-Myc-CMV-24-SAG1和p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-ROP18在293T細(xì)胞中表達(dá)。
　　小鼠脾臟T細(xì)胞亞群CD4+T、CD8+T動(dòng)態(tài)分析，CD4+T細(xì)胞在各組的增殖無(wú)明顯差異(P＞0.05);SAG1組、ROP18組、全量混合組和半量混合組的CD8+T細(xì)胞較PBS組和空載體組增殖明顯(P

7、＜0.01);半量混合組較全量混合組、SAG1組、ROP18組CD8+T細(xì)胞增殖明顯(P＜0.05)。CD4+T/CD8+T比值，半量混合組、全量混合組、SAG1組和ROP18組較PBS組和空載體組差異顯著(P＜0.05）。
　　Real-time PCR檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞因子，各組小鼠IL-4的含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);全量混合組和半量混合組小鼠脾細(xì)胞IL-12的含量比PBS組和空載體組高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.0

8、5);全量混合組和半量混合組小鼠脾細(xì)胞IFN-γ的含量比PBS組和空載體組高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);半量混合組小鼠脾細(xì)胞IFN-γ的含量比ROP18組高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　弓形蟲速殖子接種感染小鼠，SAG1組、ROP18、全量混合組和半量混合組較PBS組和空載體組的生存時(shí)間均有延長(zhǎng)(P＜0.05)，半量混合組較全量混合組的生存時(shí)間也顯著延長(zhǎng)(P＜0.01)，但全量混合組與SAG1組和ROP18