弓形蟲(chóng)表面抗原SAG3和SAG1基因的克隆表達(dá)、純化及鑒定.pdf

1、目的：運(yùn)用PCR體外擴(kuò)增法獲取弓形蟲(chóng)表面抗原SAG3和SAG1目的基因片段，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET29a(+)-SAG3和pET29a(+)-SAG1，分別在大腸埃希菌(Escherichia coli)中誘導(dǎo)表達(dá)SAG3和SAG1重組蛋白，利用鎳離子柱分離純化重組蛋白，蛋白印跡(Western blotting)檢測(cè)重組蛋白的抗原性，為弓形蟲(chóng)病的混合多價(jià)蛋白疫苗和核酸疫苗研制奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：從RH株弓形蟲(chóng)保種小鼠腹水中

2、收集滋養(yǎng)體，用小量組織/細(xì)胞基因組DNA抽提試劑盒提取弓形蟲(chóng)基因組DNA。根據(jù)GenBank中弓形蟲(chóng)RH標(biāo)準(zhǔn)株的SAG3和SAG1基因序列，利用Primer5.0軟件分別各設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，以基因組DNA為模板，進(jìn)行體外PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、測(cè)序和BLAST同源比對(duì)分析鑒定，獲得SAG3和SAG1基因片段。SAG3基因片段經(jīng)Biospin膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化，連接至pUCm-T載體中構(gòu)建克隆質(zhì)粒pUCm-T-SAG3，

3、以菌落PCR、雙酶切和測(cè)序方法鑒定，用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、EcoRⅠ從pUCm-T-SAG3中切下SAG3基因片段，亞克隆至質(zhì)粒pET29a(+)中；而SAG1基因片段回收純化后則直接用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切后定向克隆至質(zhì)粒pET29a(+)中。構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pET29a(+)-SAG3和pET29a(+)-SAG1均采用菌落PCR、雙酶切和測(cè)序等方法進(jìn)行鑒定。將重組表達(dá)質(zhì)粒pET29a(+)-SAG3和pET29a

4、(+)-SAG1分別轉(zhuǎn)入E.coliBL21中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析重組蛋白表達(dá)情況，并用SPSS軟件對(duì)重組蛋白分子量進(jìn)行計(jì)算分析。用小鼠Anti-His抗體作一抗經(jīng)Western blotting鑒定重組蛋白的組氨酸標(biāo)簽。重組蛋白經(jīng)鎳離子柱純化后，再用Western blotting分析純化的重組蛋白與小鼠弓形蟲(chóng)陽(yáng)性血清的免疫反應(yīng)性。
　　 結(jié)果：用SAG3和SAG

5、1特異性引物進(jìn)行PCR體外擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳和測(cè)序分析，分別獲得長(zhǎng)1059bp和799 bp的基因片段，BLAST同源性分析顯示兩個(gè)目的片段與弓形蟲(chóng)RH株相對(duì)應(yīng)的SAG3基因和SAG1基因的eDNA同源性為100％。克隆質(zhì)粒pUCm-T-SAG3經(jīng)鑒定，瓊脂糖凝膠電泳顯示在1000bp以上處有特異性條帶，測(cè)序結(jié)果也顯示SAG3目的基因片段的已正確地插入克隆質(zhì)粒T7啟動(dòng)子下游，并含有NdeⅠ、EcoRⅠ酶切位點(diǎn)。重組表達(dá)質(zhì)粒pET29a

6、(+)-SAG3和pET29a(+)-SAG1經(jīng)菌落PCR和雙酶切鑒定后瓊脂糖凝膠電泳顯示分別在1000bp和800bp處得到與預(yù)期SAG3和SAG1目的基因片段大小一致的條帶，測(cè)序鑒定后顯示兩個(gè)目的基因片段均插入重組表達(dá)質(zhì)粒pET29a(+)序列T7啟動(dòng)子及核糖結(jié)合位點(diǎn)(rbs)AAGGAG序列的下游NdeⅠ酶切位點(diǎn)處，通過(guò)讀碼分析在重組蛋白末端能表達(dá)質(zhì)粒自身所帶的組氨酸標(biāo)簽。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，兩個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒均能在BL21中穩(wěn)定表達(dá)

7、重組蛋白，通過(guò)SDS-PAGE電泳檢測(cè)到特異性蛋白表達(dá)條帶，用直線相關(guān)分析得出重組蛋白SAG3和SAG1的相對(duì)分子量(Mr)分別為41366.2和29991.6。兩種重組蛋白用Western blotting檢測(cè)后均能與小鼠Anti-His抗體有特異性反應(yīng)條帶。用鎳離子柱純化后經(jīng)SDS-PAGE電泳顯示出兩種重組蛋白均可得到背景清晰的純化蛋白條帶，純化重組蛋白通過(guò)Western blotting檢測(cè)，兩種純化重組蛋白能與小鼠弓形蟲(chóng)感染血

8、清有特異反應(yīng)條帶。
　　 結(jié)論：用PCR方法成功從弓形蟲(chóng)RH株速殖子基因中擴(kuò)增出長(zhǎng)為1059bp的SAG3和799 bp的SAG1基因片段。成功地構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET29a(+)-SAG3和pET29a(+)-SAG1，使弓形蟲(chóng)表面抗原SAG3和SAG1重組蛋白在體外獲得表達(dá)，兩種重組表達(dá)蛋白具有較好的活性。用鎳離子柱成功純化出重組蛋白SAG3和SAG1，兩種純化的重組蛋白亦顯示出了良好的抗原性。以此推測(cè)出SAG3和SAG1基