弓形蟲(chóng)SAG2、GRA6、GRA7基因的重組表達(dá)及應(yīng)用研究.pdf

1、研究背景與目的：弓形蟲(chóng)(Toxopasma gondii)是嚴(yán)重影響健康的機(jī)會(huì)致病原蟲(chóng)。能在人類與家畜之間傳播，呈世界性分布。它可侵犯除健康成熟紅細(xì)胞以外的有核細(xì)胞，引起多器官組織的病變。對(duì)于正常人群，機(jī)體免疫力正常，則感染弓形蟲(chóng)后常為無(wú)癥狀帶蟲(chóng)狀態(tài)，然而對(duì)于特殊人群如當(dāng)患有艾滋病、結(jié)核、腫瘤、器官移植后等免疫功能受損或抑制時(shí)，弓形蟲(chóng)就機(jī)會(huì)性感染引起明顯的臨床癥狀，甚至死亡。若孕婦患有弓形蟲(chóng)感染可引起胎兒畸形及流產(chǎn)，嚴(yán)重者可出現(xiàn)死胎。在

2、家禽之間的傳播導(dǎo)致大量家禽的死亡，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因而預(yù)防弓形蟲(chóng)病的發(fā)生，早期診斷弓形蟲(chóng)病具有很大的臨床價(jià)值。然而弓形蟲(chóng)寄生于宿主細(xì)胞內(nèi)，直接取弓形蟲(chóng)病原體困難，而臨床表現(xiàn)無(wú)特異性，單靠臨床診斷非常困難。目前常用的方法有病原學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)，每種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。病原體直接鏡檢是傳統(tǒng)方法，特異性高但容易漏診，不能適應(yīng)臨床需要。免疫學(xué)診斷方法敏感性及特異性高，操作相對(duì)便捷，所以應(yīng)用免疫學(xué)方法診斷弓形蟲(chóng)病更為重要。隨著近幾年分子生物

3、學(xué)的發(fā)展，將有診斷價(jià)值的弓形蟲(chóng)抗原分子克隆到原核或真核表達(dá)載體，進(jìn)行表達(dá)、純化，從而獲得高純度抗原，特異性高，應(yīng)用廣泛。 SAG2是表面抗原蛋白，GRA6、GRA7是致密顆粒蛋白，具有較強(qiáng)的抗原性和免疫原性。本研究首先構(gòu)建了弓形蟲(chóng)的 RH株 SAG2、GRA6和 GRA7基因的重組質(zhì)粒pGEX-4T-SAG2、pGEX-4T-GRA6和pGEX-4T-GRA7，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌BL21，然后用IPTG體外誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，純

4、化的蛋白作為包被抗原，對(duì)358份人源血清進(jìn)行ELISA檢測(cè)，為SAG2、GRA6和GRA7作為人、獸弓形蟲(chóng)病診斷抗原的研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法：1．目的基因的擴(kuò)增從弓形蟲(chóng)感染的小鼠腹水中提取RH株的基因組DNA，然后以提取的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳鑒定純化回收。2．重組質(zhì)粒的構(gòu)建將PCR產(chǎn)物及載體pGEX-4T分別進(jìn)行雙酶切(EcoRI、BamHI)，通過(guò)回收試劑盒回收酶切片段，將獲取的目的片段與載體進(jìn)行連接

5、，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞。酶切鑒定后送基因公司測(cè)序。3.重組質(zhì)粒的表達(dá)和純化IPTG體外誘導(dǎo)表達(dá)，利用His-bindTM柱柱純化融合蛋白，SDS-PAGE和免疫印跡分析。
　　結(jié)果：1. PCR特異地?cái)U(kuò)增出目的基因，SAG2、GRA6和GRA7擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定，大小分別為561、693和714bp，長(zhǎng)度與理論值相符。2.重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRI、BamHI雙酶切，電泳顯示在相應(yīng)位置出現(xiàn)條帶，與預(yù)期大小（

6、561、693和714bp）一致。對(duì)酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行送樣測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)比對(duì)后與原始序列同源性100％，表明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒。3.采取各組份樣品，進(jìn)行 SDS-PAGE分析，電泳顯示在相應(yīng)位置（47KD、52KD、53KD）出現(xiàn)明顯條帶，表明融合蛋白SAG2、GRA6和GRA7成功得到了表達(dá)，表達(dá)主要方式為包涵體表達(dá)。4.融合蛋白經(jīng)過(guò)免疫印跡分析，在相應(yīng)位置（47KD、52KD、53KD）出現(xiàn)明顯條帶，表明融合蛋白SAG2、