弓形蟲GRA1與HBsAg二價核酸疫苗的研究.pdf

1、目的:構(gòu)建乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和弓形蟲致密顆?？乖?1(GRA1)融合基因真核表達(dá)載體pcDNA3-HBsAg-GRA1,觀察該二價DNA疫苗的保護(hù)性.方法:1.構(gòu)建融合基因表達(dá)載體pcDNA3-HBsAg-GRA1采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增出HBsAg前224個氨基酸的編碼基因,用BclⅠ/EcoRⅠ雙酶切、純化;PCR擴增出GRA1的編碼基因,用EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切、純化;用BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切真核表達(dá)質(zhì)粒

2、pcDNA3、并純化;將HBsAg-GRA1定向克隆到pcDNA3的BamHⅠ/XhoⅠ位點;對重組子進(jìn)行PCR擴增、雙酶切初步鑒定后做序列測定;2.構(gòu)建pcDNA3-HBsAg真核表達(dá)載體PCR擴增出編碼HBsAg226個氨基酸的基因,用Hind Ⅲ/EcoRⅠ雙酶切真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3,將HBsAg226氨基酸的編碼基因定向克隆到pcDNA3 Hind Ⅲ/EcoRⅠ位點,對重組子進(jìn)行PCR擴增、雙酶切初步鑒定后做序歹測定;3.

3、將融合基因真核表達(dá)載體pcDNA3-HBsAg-GRA1轉(zhuǎn)染入體外培養(yǎng)的COS-7細(xì)胞,培養(yǎng)48h后收集COS-7細(xì)胞,采用ELISA、SDS-PAGE、Western blot檢測表達(dá)蛋白的生化特性和免疫活性;4.大量提取重組質(zhì)粒pcDNA3-HBsAg-GRA1、pcDNA3-HBsAg、pcDNA3-GRA1、及空質(zhì)粒pcDNA3,通過肌肉注射免疫BALB/c小鼠,ELISA法檢測抗體及抗體亞類水平,PCR檢測肌肉組織DNA中HB

4、sAg、GRA1編碼基因,用弓形蟲速殖子分別攻擊感染免疫鼠及對照鼠,觀察比較其存活時間.結(jié)果:1.成功構(gòu)建重組融合基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-HBsAg-GRA1,序列測定表明已將大小為1245bp的HBsAg-GRA1融合基因定向克隆到pcDNA3的BamHⅠ/XhoⅠ位點;2.成功構(gòu)建乙肝表面抗原真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-HBsAg,序列測定表明已將大小為678bp的HBsAg主蛋白S蛋白完整開放閱讀框定向克隆到pcDNA3的Hi

5、nd Ⅲ/EcoRⅠ位點;3.成功將pcDNA3-HBsAg-GRA1轉(zhuǎn)染入COS-7細(xì)胞,且表達(dá)了具有免疫活性的融合蛋白,分別被HBsAb陽性血清及弓形蟲免疫兔血清識別.4.經(jīng)pcDNA3-HBsAg-GRA1免疫的小鼠血清中GRA1抗體明顯高于pcDNA3-GRA1組及混合免疫組;HBsAb陽性,滴度達(dá)1:800,各免疫組之間無明顯差異;弓形蟲RH株攻擊后,pcDNA3-HBsAg-GRA1免疫組存活時間明顯長于其他各組.結(jié)論:成功