精液傳播弓形蟲(chóng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、弓形蟲(chóng)病由弓形蟲(chóng)而引起，該蟲(chóng)體可寄生于人類(lèi)及多數(shù)溫血?jiǎng)游铮鹑双F共患弓形蟲(chóng)病。人類(lèi)免疫力正常時(shí)其感染通常沒(méi)有癥狀，但對(duì)免疫缺陷者可引起致死性損害，屬最常見(jiàn)的機(jī)會(huì)致病原蟲(chóng)。孕婦感染弓形蟲(chóng)后，蟲(chóng)體多數(shù)能傳給胎兒造成先天性損害。在畜牧業(yè)，弓形蟲(chóng)能引起動(dòng)物疾病及胚胎流產(chǎn)而造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失和影響畜牧業(yè)發(fā)展。 該蟲(chóng)生活史復(fù)雜，存在著眾多的感染途徑。目前已知蟲(chóng)體能經(jīng)口傳播，通常因生食、或半生食動(dòng)物肉類(lèi)或飲水而感染。孕婦感染弓形蟲(chóng)后蟲(chóng)體由胎

2、盤(pán)傳給胎兒。能經(jīng)輸血而傳播；也存在著經(jīng)傷口接觸蟲(chóng)體而導(dǎo)致感染的可能性。還有報(bào)導(dǎo)因貓咬傷而感染弓形蟲(chóng)。 近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，弓形蟲(chóng)病的分布有以下特點(diǎn)：歐美地區(qū)感染率高，而欠發(fā)達(dá)地區(qū)其感染率低。在我國(guó)弓形蟲(chóng)感染率有逐年增高的趨勢(shì)，1985～1996年國(guó)內(nèi)平均感染率為4.9％。2004年的國(guó)內(nèi)弓形蟲(chóng)感染率為7.88％。感染率升高的原因與國(guó)內(nèi)居民飲食習(xí)慣，接觸貓科動(dòng)物等因素有關(guān)系。但是否與社會(huì)性觀念的改變及婚外性行為的增加有關(guān)尚不得而知。

3、 弓形蟲(chóng)寄生在宿主除紅細(xì)胞以外的所有有核細(xì)胞內(nèi)，常見(jiàn)的受損器官有腦、眼、心、肝、肺、腎等。在睪丸組織和精液中已發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)體的存在。而且在女性陰道分泌物內(nèi)已檢測(cè)到蟲(chóng)體DNA的存在。弓形蟲(chóng)能否經(jīng)性行為傳播及雌性陰道狀態(tài)對(duì)精液傳播弓形蟲(chóng)的影響是一個(gè)至今尚未深入探討的話題。 多年來(lái)，由于弓形蟲(chóng)蟲(chóng)體的微小及在宿主體內(nèi)常以隱性感染狀態(tài)出現(xiàn)，因此弓形蟲(chóng)的感染檢測(cè)?？棵庖邔W(xué)手段進(jìn)行；檢測(cè)方式均為定性檢測(cè)。而其病原學(xué)檢測(cè)常采用小鼠腹腔接種的方式。因

4、此，對(duì)弓形蟲(chóng)蟲(chóng)體本身在宿主體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化未能進(jìn)行研究。1996年熒光定量PCR技術(shù)的出現(xiàn)及2000年在弓形蟲(chóng)檢測(cè)上的應(yīng)用為研究帶來(lái)希望。因此本文以RH株弓形蟲(chóng)為蟲(chóng)株，以家兔為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物建立雄性弓形蟲(chóng)感染模型和雌兔不同陰道健康狀態(tài)模型。采用普通PCR和熒光定量PCR技術(shù)對(duì)雄性家兔血液、精液中蟲(chóng)體進(jìn)行了動(dòng)態(tài)觀察；通過(guò)弓形蟲(chóng)抗體和DNA的檢測(cè)，觀察了不同陰道健康狀態(tài)的雌兔在利用感染弓形蟲(chóng)的雄兔精液授精后雌兔的感染情況。 一、家兔實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

5、模型的建立 建立雄性家兔弓形蟲(chóng)感染模型和雌性家兔不同陰道健康狀態(tài)模型。用16只健康成年新西蘭雄兔，每只經(jīng)腹腔感染RH株弓形蟲(chóng)速殖子10萬(wàn)個(gè)，在感染前后耳緣靜脈每周采集外周血，制備全血標(biāo)本和血清標(biāo)本；假陰道法采集精液標(biāo)本。27只雌性成年健康家兔，體重3kg左右，隨機(jī)分為4組。第一組，陰道正常組(7只雌兔)；第二組，陰道損傷組(7只)；第三組，陰道毛滴蟲(chóng)感染組(7組)；第四組，白色念珠菌感染組(6只)。第一組雌性家兔為陰道健康狀態(tài)組

6、；第二組每天用消毒棉簽插拭陰道，出血為止。第三組每天用培養(yǎng)的陰道毛滴蟲(chóng)蟲(chóng)體液滴加陰道內(nèi)，直至陰道有淡黃色分泌物出現(xiàn)，且分泌物內(nèi)顯微鏡下能查到滴蟲(chóng)蟲(chóng)體為止。第四組每天陰道內(nèi)滴加培養(yǎng)的白色念珠菌菌液，直至陰道分泌物中查見(jiàn)菌體為止。 結(jié)論表明： RH株蟲(chóng)體以1×105劑量感染家兔，死亡率在50％左右，精液標(biāo)本采集較血液困難。利用雌性家兔能建立類(lèi)似于人類(lèi)陰道健康狀況的模型。 二、弓形蟲(chóng)感染動(dòng)物免疫學(xué)檢測(cè)方法的建立

7、 建立家兔血清中弓形蟲(chóng)IgG抗體檢測(cè)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。用純化后的RH株弓形蟲(chóng)速殖子反復(fù)凍融、多次超聲粉碎后超速離心，取上清制備蟲(chóng)體抗原，包被進(jìn)口酶標(biāo)反應(yīng)板。用已知混合的弓形蟲(chóng)感染陽(yáng)性血清倍比稀釋后滴加酶標(biāo)反應(yīng)孔內(nèi)，以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體作為二抗，鄰苯二胺為底物進(jìn)行棋盤(pán)滴定以獲得最佳的抗原包被濃度及血清稀釋度。 結(jié)論表明： 本次建立的家兔血清中抗體檢測(cè)ELISA方法是成功的。 三、弓形蟲(chóng)感

8、染動(dòng)物體液中蟲(chóng)體DNA的定性檢測(cè)方法的建立 評(píng)價(jià)國(guó)內(nèi)公司研制的弓形蟲(chóng)PCR檢測(cè)試劑盒，篩選出較好的檢測(cè)方法用于家兔體液中蟲(chóng)體DNA檢測(cè)。采用市售的國(guó)內(nèi)生產(chǎn)的4種弓形蟲(chóng)PCR試劑盒檢測(cè)弓形蟲(chóng)陽(yáng)性兔的血液及精液標(biāo)本。 結(jié)果表明： 溫州伊利康TOX-PCR試劑盒、北京美迪科TOX-PCR試劑盒對(duì)家兔感染前后血液、精液標(biāo)本均未出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果。上海復(fù)生TOX-PCR試劑盒檢測(cè)家兔精液標(biāo)本感染前陰性，感染后均能出現(xiàn)相應(yīng)的結(jié)果，

9、而檢測(cè)血液標(biāo)本雜帶太多。洛陽(yáng)華美TOX-PCR試劑盒檢測(cè)家兔血液標(biāo)本、精液感染前均為陰性，感染后血液標(biāo)本陽(yáng)性率76.53％，43份精液標(biāo)本陽(yáng)性率2.33％。 結(jié)論表明： 目前國(guó)內(nèi)市售的TOX-PCR試劑盒可檢測(cè)各種組織標(biāo)本，但實(shí)際應(yīng)用價(jià)值局限。復(fù)生試劑盒適合于家兔精液中弓形蟲(chóng)DNA的檢測(cè)；華美公司試劑適合于血液中蟲(chóng)體DNA的檢測(cè)。 四、弓形蟲(chóng)感染動(dòng)物體液中蟲(chóng)體DNA的定量檢測(cè)方法的建立 利用TaqMan探

10、針?lè)ń晒舛縋CR進(jìn)行家兔血液、精液中蟲(chóng)體DNA的定量檢測(cè)。用弓形蟲(chóng)蟲(chóng)體單拷貝熱休克蛋白基因Hsp20(基因總長(zhǎng)度片段為240bp,表達(dá)產(chǎn)生20kd的熱休克蛋白)，設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，其序列如下：F：5‘-GCGACATGGACGAGATGCT-3’R：5‘-CAGTTGGCCTTCGCCGACC-3’，建立熒光定量PCR技術(shù)。采用堿加熱法提取精液中總DNA，碘化鈉法提取血液中總DNA。采用美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司QRT-PCR儀PE70

11、00進(jìn)行PCR反應(yīng)。 結(jié)果表明： 8份感染前的全血均陰性；感染后1～3周全血7份全部陽(yáng)性。感染前雄兔精液6份檢測(cè)均為陰性；感染后4～9周5份精液3份(3/5)能測(cè)定出一定蟲(chóng)體密度。 結(jié)論表明： 本次建立的熒光定量PCR技術(shù)敏感性和特異性能滿足定量檢測(cè)需要。 五、弓形蟲(chóng)感染家兔血液、精液中蟲(chóng)體的動(dòng)態(tài)研究 觀察弓形蟲(chóng)蟲(chóng)體在血液、精液中動(dòng)態(tài)變化情況。對(duì)比普通PCR和FQ-PCR檢測(cè)感染家兔血液中

12、弓形蟲(chóng)基因動(dòng)態(tài)檢測(cè)結(jié)果。用RH株弓形蟲(chóng)速殖子105個(gè)/只的劑量腹腔感染雄性家兔16只。在家兔感染前后分別采集血液、精液，-40℃凍存?zhèn)溆?。普通PCR連續(xù)檢測(cè)血液標(biāo)本中蟲(chóng)體DNA基因片段；用實(shí)時(shí)定量PCR(QRT-PCR)方法檢測(cè)弓形蟲(chóng)感染家兔血液、精液中弓形蟲(chóng)DNA拷貝量，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出血液、精液中蟲(chóng)體密度，繪制感染后時(shí)間與血液、精液中蟲(chóng)體含量的動(dòng)態(tài)曲線圖。 結(jié)果表明： FQ-PCR檢測(cè)：感染前雄性家兔血液檢測(cè)均為陰

13、性，感染后血液總陽(yáng)性率為64.42％。血液中蟲(chóng)體密度高峰期在感染后1wk左右，其密度最高值為2.48×105個(gè)/ml，其后長(zhǎng)期維持在較低水平，感染后121d血液蟲(chóng)體密度達(dá)最低值為1.45×103個(gè)/ml。精液檢測(cè)總陽(yáng)性率為26.67％，最早在感染后7d能檢測(cè)到蟲(chóng)體DNA，精液中蟲(chóng)體最大密度值為1.48×105個(gè)/ml，高峰期在感染后7wk左右，峰期過(guò)后，精液中蟲(chóng)體密度維持在平臺(tái)期水平，至感染后第15wk，精液中仍有4.68×103個(gè)/m

14、l蟲(chóng)體存在。 普通PCR檢測(cè)：感染家兔血液中蟲(chóng)體DNA檢測(cè)總陽(yáng)性率為45％，感染后第1wk檢出率僅22％，高峰期維持在感染后2～4wk,檢出率約為60％左右。其后檢出率下降為25％左右并一直維持。用普通PCR檢測(cè)感染雄兔精液，感染后8d有較強(qiáng)反應(yīng)，感染72d仍有陽(yáng)性反應(yīng)出現(xiàn)。 結(jié)論表明： 兩種PCR檢測(cè)方法有相同的動(dòng)態(tài)檢出效果，采用血液作為樣品進(jìn)行弓形蟲(chóng)PCR檢測(cè)時(shí)其最佳檢測(cè)時(shí)間為感染后1～4wk，其后檢出率逐漸

15、下降。弓形蟲(chóng)感染雄兔其血液、精液中蟲(chóng)體含量動(dòng)態(tài)變化不同。 六、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物精液傳播弓形蟲(chóng)的研究 為了解弓形蟲(chóng)能否通過(guò)精液傳播，并探討雌兔陰道不同健康狀態(tài)對(duì)精液傳播弓形蟲(chóng)的影響。8只健康新西蘭雄兔經(jīng)腹腔分別感染1×105個(gè)RH株弓形蟲(chóng)速殖子，分別于感染前、后用假陰道采集雄兔精液，每周將采集到的精液混合液化后分別經(jīng)宮腔內(nèi)人工授精管感染4組(0.1ml/只))陰道健康狀態(tài)不同的成年新西蘭雌兔(陰道正常組、陰道損傷組、滴蟲(chóng)性陰道炎組

16、和霉菌性陰道炎組)，共采集8周，將所得8份混合精液分別感染8次。每次授精后第2～3天耳緣靜脈采血(2ml)，分別用ELISA和PCR檢測(cè)血清抗弓形蟲(chóng)抗體和全血中弓形蟲(chóng)B1基因片段。ELISA結(jié)果顯示，雌兔在初次受精后第16天可檢測(cè)到抗弓形蟲(chóng)IgG抗體，第1～4組抗體陽(yáng)性家兔數(shù)分別有2、1、3和1只，ELISA陽(yáng)性率為25.9％(7/27)。PCR檢測(cè)最早在授精后3d和最晚51d可擴(kuò)增出弓形蟲(chóng)B1基因片段200bp，第1～4組陽(yáng)性家兔數(shù)分

17、別有2、1、2和0只，PCR陽(yáng)性率為18.5％(5/27)。其中兩種檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性的有3只。結(jié)論弓形蟲(chóng)可通過(guò)精液感染雌兔。雌兔的陰道健康狀態(tài)對(duì)經(jīng)精液感染弓形蟲(chóng)無(wú)影響。 本項(xiàng)研究得出如下結(jié)論：用1×105個(gè)/只RH株弓形蟲(chóng)速殖子感染16只雄性家兔時(shí)，有8只在感染后的7～14d死亡。用27只雌性家兔，成功建立了4種不同陰道健康狀態(tài)模型。用建立的普通PCR和熒光定量PCR進(jìn)行血液中蟲(chóng)體DNA檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，其最佳檢測(cè)時(shí)間為感染后1～4周