金絲桃素抗弓形蟲效果的研究.pdf

1、目的：
　　1．實驗研究金絲桃素對體外培養(yǎng)的弓形蟲速殖子的殺傷作用，以及金絲桃素對弓形蟲形態(tài)結(jié)構(gòu)、超微結(jié)構(gòu)影響。2．探討金絲桃素對體外培養(yǎng)的弓形蟲細胞逸出現(xiàn)象的影響。3．探討金絲桃素對急性弓形蟲感染小鼠的治療作用及其可能的細胞免疫調(diào)節(jié)機制。
　　方法：
　　1．調(diào)整蟲體密度為1×106個/ml/孔于24孔板中，設(shè)4個實驗組：生理鹽水組、金絲桃素5μg/ml、50μg/ml、500μg/ml濃度組，定容至1ml/孔。37

2、℃孵育，2h、4h、6h分別取各組樣本液，進行臺盼藍和姬姆薩染色，光鏡下觀察蟲體著色情況和蟲體結(jié)構(gòu)。電鏡觀察藥物濃度為500μg/ml作用2h、4h、6h后，蟲體的超微結(jié)構(gòu)的變化。
　　2．用RH-YFP弓形蟲模擬方法1實驗方案利用熒光顯微鏡觀察和流式細胞儀檢測金絲桃素對弓形蟲的殺傷作用；分離小鼠腹腔巨噬細胞，建立弓形蟲與巨噬細胞共培養(yǎng)體系，實驗分4組:巨噬細胞+弓形蟲組、巨噬細胞+弓形蟲+金絲桃素組（金絲桃素濃度：100μg/m

3、l、200μg/ml、400μg/ml），分別在培養(yǎng)1h、2h、3h后用熒光顯微鏡觀察和流式細胞儀檢測，檢測感染細胞、游離速殖子在不同藥物濃度及不同時間比例的變化。
　　3．利用弓形蟲RH株（1×103個/只）建立小鼠弓形蟲體內(nèi)感染模型，實驗分成空白組、感染組、金絲桃素組、金絲桃素治療組4個實驗組。感染12小時后金絲桃素對照組和治療組開始給藥，連續(xù)治療7天。觀察小鼠存活時間，利用流式細胞儀檢測7天后小鼠脾臟中T淋巴細胞亞群的變化。

4、
　　結(jié)果：
　　1．金絲桃素和弓形蟲速殖子共培養(yǎng)后，隨著時間的變化，同一濃度組臺盼藍著色率不斷升高，在相同的時間段內(nèi)，隨著藥物濃度的增加，蟲體臺盼藍著色率也在升高。吉姆薩染色實驗，其中500μg/ml濃度組2h蟲體內(nèi)部出現(xiàn)空泡，4h后蟲體膨脹，核質(zhì)分不清，6h后蟲體染色進一步加深。透射電鏡下速殖子超微結(jié)構(gòu)的變化，生理鹽水組蟲體輪廓清晰，電子密度高，內(nèi)容物清楚，6h內(nèi)基本維持正常形態(tài)。金絲桃素處理組2h后，蟲體開始腫脹，鈍圓

5、，胞質(zhì)內(nèi)開始出現(xiàn)空泡，核固縮。4h后蟲體變圓，空泡變大，胞膜出現(xiàn)孔洞，有內(nèi)容物溢出。6h后蟲體輪廓消失，不見細胞膜，內(nèi)部結(jié)構(gòu)基本呈溶解樣改變，電子密度很低。
　　2．弓形蟲對照組6h內(nèi)蟲體數(shù)目形態(tài)基本沒有變化，500μg/ml作用2h蟲體開始鈍圓，熒光輪廓變小，4h后熒光速殖子明顯減少，6h后基本不見熒光；巨噬細胞組金絲桃素干預(yù)3h細胞形態(tài)未發(fā)生明顯改變。與巨噬細胞+弓形蟲組相比，巨噬細胞+弓形蟲+金絲桃素組隨著藥物濃度增加和時間

6、的延長胞內(nèi)速殖子數(shù)量下降明顯，游離速殖子也在減少且熒光強度不斷降低。流式細胞儀檢測結(jié)果，弓形蟲對照組6h內(nèi)陽性區(qū)域比例變化不明顯，藥物處理2h，500μg/ml藥物濃度，游離速殖子陽性區(qū)域比例開始小于0.1％；巨噬細胞+弓形蟲+藥物組隨著時間的延長和藥物濃度增加，游離/胞內(nèi)弓形蟲的比值開始不斷升高直到400μg/ml作用3h才開始下降，各時間段實驗組與對照組比較均顯著升高。
　　3．對40只小鼠進行連續(xù)7天干預(yù)治療后，金絲桃素組，

7、金絲桃素治療組，空白組30只小鼠全部存活，感染組小鼠只存活了5只。7天后處死小鼠進行腹水檢查發(fā)現(xiàn)，金絲桃素治療組小鼠腹腔速殖子含量較感染組少。小鼠脾淋巴細胞檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)金絲桃素對照組和治療組CD4+T淋巴細胞比例較其他2組顯著升高，而感染組小鼠脾CD8+T淋巴細胞比例較其他3組也顯著升高。CD4+/CD8+T淋巴細胞比例金絲桃素對照組和治療組顯著高于空白對照組與感染組。
　　結(jié)論：
　　1．在體外培養(yǎng)環(huán)境下，金絲桃素對弓形蟲

8、速殖子有顯著的殺傷作用，500μg/ml濃度4h就可以達到95%以上的殺傷效果，與同一濃度4h在熒光顯微鏡下蟲體熒光消失和電鏡下蟲體超微結(jié)構(gòu)變化相一致。
　　2．體外藥物實驗證實了金絲桃素能夠誘導(dǎo)弓形蟲速殖子從宿主細胞逸出，降低宿主細胞的感染率，同時對逸出的游離速殖子具有殺滅作用。
　　3．通過金絲桃素治療小鼠弓形蟲病的體內(nèi)實驗表明，金絲桃素可以影響弓形蟲感染小鼠體內(nèi)CD4+/CD8+T淋巴細胞亞群比例的變化，延長了感染弓形