人-兔嵌合型抗弓形蟲IgM抗體基因庫的構(gòu)建和抗弓形蟲IgG抗體參考物質(zhì)的研究.pdf

1、剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種可寄生于有核細(xì)胞的原蟲，能感染人和動(dòng)物，引發(fā)弓形蟲病。成年人多為隱形感染，但對(duì)于某些特定人群，感染可引起嚴(yán)重的臨床癥狀，這些人群包括孕婦、艾滋病、器官移植、惡性腫瘤患者等。臨床實(shí)驗(yàn)室弓形蟲檢測(cè)主要依靠免疫血清學(xué)檢測(cè)，檢測(cè)項(xiàng)目通常包括特異IgM和IgG等。在檢測(cè)中，為了排除假陰性結(jié)果，控制檢驗(yàn)操作過程，保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，需要陽性質(zhì)控品進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)量控制和室間質(zhì)量評(píng)價(jià)。我們前期的研究采

2、用基因工程抗體技術(shù)將鼠的抗弓形蟲P30抗原IgG抗體可變區(qū)基因與人IgM抗體恒定區(qū)基因進(jìn)行了拼接，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)得到了鼠-人嵌合抗弓形蟲IgM抗體，對(duì)嵌合抗體作為IgM檢測(cè)質(zhì)控替代品進(jìn)行了探索，但是此嵌合抗體僅針對(duì)弓形蟲P30抗原，不能完全模擬人血清樣本中的能針對(duì)弓形蟲多個(gè)抗原多個(gè)表位的特異性抗體。針對(duì)此問題，本課題中我們擬用弓形蟲天然抗原免疫家兔，測(cè)定效價(jià)后取兔外周血單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液處理后提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cD

3、NA，作為模板，分別擴(kuò)增兔抗弓形蟲抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)基因庫，分別與人輕鏈恒定區(qū)和重鏈恒定區(qū)基因重組，制備了人-兔嵌合型抗弓形蟲IgM抗體輕鏈和重鏈基因庫，未來其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)后可得到多克隆抗體，或可從中進(jìn)一步篩選出高親合力的人-兔嵌合基因工程抗體，二者均可作為質(zhì)控品的替代品。該嵌合型輕、重鏈基因庫的成功克隆和人源化表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建為下一步人源化人-兔嵌合型抗弓形蟲抗體IgM抗體的表達(dá)和高親合力抗體的篩選打下了基礎(chǔ)，并向人-兔嵌合型

4、抗弓形蟲抗體IgM作為弓形蟲抗體IgM檢測(cè)質(zhì)控品的應(yīng)用邁進(jìn)了一步。
　　弓形蟲特異IgG抗體的免疫血清學(xué)檢測(cè)方法有多種，以酶聯(lián)免疫法和化學(xué)發(fā)光方法在臨床實(shí)驗(yàn)室篩查檢測(cè)中最為常用。目前我國能提供該檢測(cè)試劑的廠家有多個(gè)，原理基本是間接法。無論采用何種檢測(cè)方法和試劑，保證在不同實(shí)驗(yàn)室、不同試劑和方法間檢測(cè)的結(jié)果具有可比性十分重要，這就是臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化的目的，實(shí)現(xiàn)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化或結(jié)果可比性的重要前提是要有統(tǒng)一的量值溯源。為此，英國國家生物

5、學(xué)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和質(zhì)控物研究所(National Institute for Biological Standards andControl，NIBSC)于2004年研制并提供了人抗弓形蟲特異IgG抗體的國際標(biāo)準(zhǔn)品，編號(hào)為01/600，含量值為20 IU，被世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）認(rèn)定為第一代抗弓形蟲IgG抗體國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。然而，國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不但較難獲取，且價(jià)格非常昂貴，不適用于我國臨床實(shí)驗(yàn)室

6、大規(guī)模使用，而此類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制又是有效開展醫(yī)療衛(wèi)生工作的需要。因此，本研究參照了有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，研制了抗弓形蟲IgG血清學(xué)參考物質(zhì)，并取得國家一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書（編號(hào):GBW09192），建立和應(yīng)用可溯源到國際標(biāo)準(zhǔn)的我國自己的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。應(yīng)用該參考物質(zhì)，將不僅使我國人類抗弓形蟲IgG血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果具有可比性，而且有了溯源性。其應(yīng)用范圍包括:
　　(1)不同試劑、不同檢測(cè)方法檢測(cè)下限的確定;
　　(2)依據(jù)該參考物質(zhì)制備的標(biāo)準(zhǔn)系列血清