弓形蟲(chóng)GRA7基因的克隆與表達(dá).pdf

1、研究背景與目的該研究首先分析弓形蟲(chóng)不同分離株GRA7基因的異同;構(gòu)建pGEX-4T-1/GRA7重組質(zhì)粒大腸桿菌表達(dá)體系,實(shí)現(xiàn)目的蛋白的體外表達(dá),并對(duì)目的蛋白的抗原性進(jìn)行分析;用純化的重組融合蛋白作為包被抗原,做ELISA,檢測(cè)陰性、陽(yáng)性血清,以期對(duì)其血清學(xué)診斷價(jià)值作出客觀的評(píng)價(jià),為新型弓形蟲(chóng)病診斷試劑盒的研制奠定基礎(chǔ).研究方法1.弓形蟲(chóng)不同分離株GRA7基因的保守性鑒定從弓形蟲(chóng)感染的小鼠腹水中提取不同分離株(RH株、ZS<,2>株和G

2、T株)的基因組DNA,然后以提取的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物電泳鑒定.利用三種限制性內(nèi)切酶(Esp3I、CfrI和MboI)對(duì)目的基因進(jìn)行酶切,并分析酶切產(chǎn)物.再將目的基因重組入載體pGEX-4T-1,送基因公司測(cè)序,序列對(duì)比分析.2.pGEX-4T-1/GRA7重組質(zhì)粒的構(gòu)建及GST融合蛋白的表達(dá)將質(zhì)粒DNA和GRA7基因分別進(jìn)行雙酶切(BamHI、EcoRI),純化、鑒定并連接酶切產(chǎn)物,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌,構(gòu)建pGEX-

3、4T-1/GRA7重組質(zhì)粒.酶切、PCR鑒定,并送基因公司測(cè)序.優(yōu)化蛋白表達(dá)條件,IPTG體外誘導(dǎo)表達(dá),對(duì)表達(dá)的融合蛋白進(jìn)行SDS-PAGE和Western-blot分析.3.融合蛋白的純化和應(yīng)用利用GSTrap FF柱純化融合蛋白,用純化的融合蛋白作為包被抗原,做ELISA,檢測(cè)陰性、陽(yáng)性血清.研究結(jié)論1.弓形蟲(chóng)不同分離株(RH株、ZS<,2>株和GT株)GRA7基因具有高度保守性.2.構(gòu)建了pGEX-4T-1/GRA7重組質(zhì)粒,成功