重組GRA5蛋白用于弓形蟲病免疫診斷的研究.pdf

1、目的：
　　原核表達和鑒定剛地弓形蟲致密顆粒蛋白5（GRA5），以期獲得大量與天然抗原活性相似的弓形蟲重組 GRA5蛋白抗原，將獲得的重組蛋白進行純化，應用純化的GRA5重組蛋白抗原包被在96孔板上，建立ELISA法檢測弓形蟲感染。
　　方法：
　　從GenBank中查到弓形蟲GRA5基因序列，根據基因序列設計合成一對引物，用RT-PCR方法將GRA5基因擴增，構建pET28a-GRA5原核表達載體，雙核酸內酶切及序列

2、測定進行鑒定， IPTG誘導 pET28a-GRA5轉化的 BL21/DE3菌， SDS-PAGE和Western-blotting分析表達產物并鑒定弓形蟲GRA5是否表達。建立以純化的重組蛋白的間接ELISA法，檢測收集樣本血清中弓形蟲特異性抗體。
　　結果：
　　成功構建剛地弓形蟲GRA5基因原核表達質粒，PCR反應擴增出為363 bp大小的GRA5基因，所構建的pET28a-GRA5原核表達載體經雙酶切顯示插入片段大小

3、與上相符，DNA測序結果表明與GenBank中錄入的GRA5基因經Blast比對序列同源性100％，原核細胞表達的該重組蛋白在SDS-PAGE和Western blot中均有顯示（約14 ku）。將重組GRA5蛋白作為抗原包被在96孔板中，建立了檢測弓形蟲感染的ELISA方法，ELISA法經過優(yōu)化后最終確定：最佳抗原包被濃度為10ug/ml、最佳條件為在37℃作用2h后，在4℃包被過夜、弓形蟲血清最佳稀釋度為1:25，最佳封閉條件為用5

4、%脫脂奶粉在37℃作用2h，二抗最佳工作濃度為1:20000，底物的最佳反應時間為20min。本實驗建立的ELISA法檢測的100例弓形蟲感染病人（血清學陽性）血清中有73例呈陽性，陽性率為73％（73/100），其中40例IgG陽性標本的陽性率為72.5%（29/40），30例IgM陽性標本的陽性率為53.3%（16/30），30例IgG、IgM均陽性標本的陽性率為93.3%（28/30），30例陰性血清標本的陽性率僅為6.7%（2/