弓形蟲(chóng)P30重組蛋白的表達(dá)、純化及診斷應(yīng)用研究.pdf

1、目的:構(gòu)建含剛地弓形蟲(chóng)(Toxoplasma gondii)表膜蛋白P30基因的表達(dá)載體,在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá),純化表達(dá)產(chǎn)物P30并進(jìn)行抗原性分析,研究P30在弓形蟲(chóng)病血清學(xué)診斷中的應(yīng)用價(jià)值。
　　方法:(1)P30蛋白的表達(dá)、純化與復(fù)性巨噬細(xì)胞培養(yǎng)弓形蟲(chóng),提取弓形蟲(chóng)DNA為模板,PCR擴(kuò)增目的片斷,將目的片斷克隆至pUCm-T Vector,酶切和PCR鑒定,再亞克隆到原核表達(dá)載體pET28b(+)中、構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28b(

2、+)/P30,經(jīng)酶切、PCR及測(cè)序鑒定后轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE和Western-Blot鑒定表達(dá)產(chǎn)物;包涵體經(jīng)8M尿素變性,Ni-NTA親和層析柱純化重組蛋白,變性蛋白經(jīng)稀釋透析復(fù)性,SDS-PAGE和Western-Blot分析和鑒定復(fù)性P30蛋白,BCA法測(cè)定復(fù)性蛋白濃度,用于ELISA包板。(2)小鼠弓形蟲(chóng)抗血清的制備及臨床弓形蟲(chóng)病患者陽(yáng)性血清的收集弓形蟲(chóng)速殖子經(jīng)-80℃反復(fù)冷凍3次,經(jīng)減毒

3、后感染昆明小鼠,制備小鼠弓形蟲(chóng)陽(yáng)性血清,收集臨床弓形蟲(chóng)病人血清。(3)弓形蟲(chóng)病人IgG抗體ELISA檢測(cè)方法的建立以純化復(fù)性后的P30包板,間接 ELISA檢測(cè)臨床弓形蟲(chóng)病人血清中抗弓形蟲(chóng)的抗體,以小鼠弓形蟲(chóng)陽(yáng)性血清為對(duì)照,同時(shí)與國(guó)外進(jìn)口試劑盒的檢測(cè)結(jié)果比較,評(píng)價(jià)純化的P30在弓形蟲(chóng)病血清學(xué)診斷中的應(yīng)用價(jià)值。
　　結(jié)果:PCR擴(kuò)增得到長(zhǎng)800bp的目的片斷,測(cè)序結(jié)果與Genbank上登錄序列一致;含pET28b(+)/P30重組菌

4、經(jīng)IPTG誘導(dǎo),SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示,得到一分子量(Mr)約30 kDa的重組蛋白,目的蛋白在菌體細(xì)胞內(nèi)以包涵體形式存在;8M尿素溶解后經(jīng)Ni-NTA親和柱純化獲得了純度大于95％的重組蛋白;復(fù)性后,得到溶解狀態(tài)的復(fù)性蛋白,Western-Blot結(jié)果顯示,該蛋白能被抗6-His單抗、小鼠抗弓形蟲(chóng)血清和部分臨床弓形蟲(chóng)病患者陽(yáng)性血清識(shí)別;以純化的P30重組蛋白為包被抗原建立間接 ELISA法,檢測(cè)小鼠抗弓形蟲(chóng)血清和臨床弓形蟲(chóng)病患者