弓形蟲P30抗原單克隆抗體的制備、鑒定及初步應用.pdf

1、目的：制備抗弓形蟲P30抗原的單克隆抗體，建立弓形蟲循環(huán)抗原檢測法，評價抗P30抗原單克隆抗體的早期診斷價值。 方法：重組質粒pET28b(+)-P30經BL21(DE3)表達，使用Ni-NTA親和層析柱純化重組P30蛋白, 經透析、復性后，定量P30蛋白。以復性的P30蛋白免疫BALB/c小鼠，分離免疫小鼠的脾細胞，在聚乙二醇的作用下與骨髓瘤細胞SP2/0融合，融合后的細胞進行HAT選擇培養(yǎng)，10~20天后篩選陽性克隆。用重組

2、P30包板，間接酶聯(lián)免疫試驗檢測雜交瘤細胞培養(yǎng)上清，陽性克隆經亞克隆建株。降植烷預處理小鼠后，腹腔注射狀態(tài)良好的雜交瘤細胞，體內誘生腹水法制備抗體，7~10天后即可收獲腹水。對腹水中的McAb先用硫酸銨沉淀法進行粗提，然后用免疫親和層析法進一步純化?？焖俣ㄐ栽嚰埛y定其亞類, ELISA法測定腹水和純化后抗體的效價，進行雜交瘤細胞核型分析、SDS-PAGE和Western blotting分析，ELISA法測定親和力。以純化McAb 2

3、H9包板，, 9D7為標記抗體建立雙單抗夾心ELISA法，檢測感染鼠血清中的弓形蟲Cag。 結果：純化、復性后P30蛋白純度> 90％，濃度512 ng/mL。篩選出 2 株抗P30抗原的單克隆抗體，命名為9D7、2H9。用體內誘生腹水法制備抗體，小鼠腹水陽性形成率為 90％ 以上，腹水收獲量平均為 6.5 mL/只。9D7、2H9重鏈分別為IgG2a、IgG1，輕鏈均為κ型。9D7和2H9腹水平均效價分別在1∶8 000和1∶

4、10 000以上，純化后效價均在1∶3 000以上，純化后McAb蛋白含量在0.8～1.6 mg/mL。Western blotting分析顯示 2 株McAb均能識別弓形蟲速殖子天然P30抗原和重組P30抗原。細胞核型分析顯示，2 株雜交瘤細胞染色體均在100條以上。9D7和 2H9識別不同抗原表位，親和力常數(shù)分別為6.13×107 M-1和7.64×109M-1。雙單抗夾心ELISA檢測鼠血清中的Cag，第4、5、6天陽性率分別為2