腎癌G250單克隆抗體的制備、鑒定及其初步應(yīng)用.pdf

1、【背景】 腎癌(RCC)是最常見的腎實(shí)質(zhì)惡性腫瘤，其發(fā)病隱襲，死亡率高，早期診斷非常困難。目前。腎癌的治療仍以手術(shù)為主，放、化療效果不佳。臨床上急需一種能早期診斷和治療。腎癌的方法。近年來，在對腎癌TAA的研究中，發(fā)現(xiàn)腎癌G250抗原具有良好腫瘤特異性，是較理想的腫瘤標(biāo)記物和腎癌診斷治療的靶點(diǎn)。國外已成功制備了鼠源性G250mAb及其嵌合抗體WX-G250(cG250)，并通過大量試驗(yàn)證實(shí)核素標(biāo)記的G250mAb和cG250具有

2、良好的診斷及治療的應(yīng)用潛力，目前已進(jìn)入臨床Ⅲ期實(shí)驗(yàn)。而國內(nèi)仍沒有制備出腎癌G250單克隆抗體，嚴(yán)重制約了國內(nèi)有關(guān)腎癌生物靶向診治研究的發(fā)展，因此，研制G250單克隆抗體使其國產(chǎn)化顯得急迫而重要。 由于單克隆抗體具有高度均一性、專一性和穩(wěn)定性的特性，被廣泛地應(yīng)用于診斷、治療、預(yù)后等各個(gè)領(lǐng)域，極大地促進(jìn)了生命科學(xué)的發(fā)展。在多種免疫方法中，DNA免疫彌補(bǔ)了傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)免疫方法的缺點(diǎn)，并能有效激發(fā)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫。對于已知DNA

3、編碼序列而又不能獲得純化的目的蛋白或獲得的抗原蛋白為低免疫原性抗原，可采用DNA免疫的方法來獲得相應(yīng)的特異性抗體。DNA免疫省時(shí)省力，為抗體的制備提供了一種新的免疫技術(shù)，其前景十分誘人。 【目的】 本研究旨在用DNA免疫的方法來制備腎癌G250單克隆抗體，并試圖建立該單抗的免疫組化方法，為今后腎癌的免疫學(xué)診斷及研究提供了手段，也為人源化抗體研制用于腎癌的放射性顯影診斷和生物導(dǎo)向治療奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。 【方法】

4、 大量提取并純化pcDNA3.0-G250重組質(zhì)粒，以其作為免疫原來免疫BALB/c小鼠，用IIFA法檢測免疫小鼠血清的效價(jià)。采用PEG法，將免疫過的小鼠脾細(xì)胞與來自同系小鼠的骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)進(jìn)行融合。在HAT選擇培養(yǎng)基篩選下，克隆生長孔用免疫熒光間接法檢測上清抗體的效價(jià)篩選出陽性克隆，并采用有限稀釋法進(jìn)行克隆化培養(yǎng)。將雜交瘤細(xì)胞注入經(jīng)降植烷預(yù)處理的BALB/c小鼠腹腔制備腹水型單抗或收集雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)液上清，并對獲得的單抗

5、進(jìn)行鑒定分析，包括單抗分泌穩(wěn)定性的鑒定、單抗類別及亞型鑒定、特異性鑒定、抗體效價(jià)測定、細(xì)胞核型分析、耐凍融性測定、熱穩(wěn)定性測定以及用Western blot法鑒定與G250蛋白的結(jié)合。利用制備的G250mAb進(jìn)行免疫組化研究，初步探討G250在腎腫瘤組織、正常腎組織以及其它腫瘤組織中的表達(dá)差異。 【結(jié)果】 獲得兩株抗G250單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為1C4和1C10，兩株單抗均為IgM類。對該單抗進(jìn)行特異性檢測，雜

6、交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清及腹水型單抗能與G250表達(dá)陽性的786-0細(xì)胞、Hela細(xì)胞、Pc-3細(xì)胞、HepG2細(xì)胞、231細(xì)胞以及T24細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)，而不與LNCap細(xì)胞、SP2/0細(xì)胞、BIU-87細(xì)胞、CHO細(xì)胞發(fā)生交叉反應(yīng)；1C4培養(yǎng)上清及腹水效價(jià)分別為1：160和1：1280，1C10培養(yǎng)上清及腹水效價(jià)分別為1：128和1：1024；兩株雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)為100±3條；其耐凍融性和耐熱性較理想，其中1C4優(yōu)于1C10；經(jīng)Wester

7、n-blot分析，在58KD處能夠與G250蛋白特異性結(jié)合，與文獻(xiàn)報(bào)道的G250的分子量大小相符。 經(jīng)免疫組化研究發(fā)現(xiàn)：G250在腎癌組織和正常腎組織的表達(dá)存在明顯差異，并且G250在不同的腎癌組織學(xué)類型中的表達(dá)也存在明顯差異，其中透明細(xì)胞癌表達(dá)最高。G250在腎癌組織的陽性表達(dá)與病例的臨床分期呈負(fù)相關(guān)。雖然G250的表達(dá)與病理分級無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但從實(shí)驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)上看，當(dāng)病理分級升高時(shí)，G250的表達(dá)也呈現(xiàn)下降的趨勢。對G250

8、在其它腫瘤表達(dá)的探索研究中，發(fā)現(xiàn)G250在其它腫瘤組織中也有廣泛地表達(dá)。 【結(jié)論】 1．在本室構(gòu)建的重組質(zhì)粒pcDNA3.0-G250基礎(chǔ)上，采用DNA免疫方法國內(nèi)首次成功制備了兩株抗G250的單抗，為腎癌的免疫學(xué)診斷和人源化改造提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。 2．應(yīng)用免疫組化方法，進(jìn)一步證實(shí)了G250在腎癌組織(尤其是透明細(xì)胞癌)表達(dá)的特異性，明確了G250表達(dá)水平與腎癌臨床及病理學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系，為今后G250功能和作用的