赭曲霉素A單克隆抗體的制備及其初步應(yīng)用.pdf

1、赭曲霉毒素（Ochratoxin）是一類有毒的微生物代謝產(chǎn)物，由曲霉屬真菌和青霉屬真菌代謝產(chǎn)生，其中毒性比較強(qiáng)的是赭曲霉毒素A(OchratoxinA，OTA)，尤其對(duì)腎臟能造成很強(qiáng)的損傷，臨床上被認(rèn)為是一種主要的腎毒素。由于在一些農(nóng)產(chǎn)品中經(jīng)常發(fā)生赭曲霉毒素中毒事件，近年來，赭曲霉毒素及其檢測(cè)研究越來越受到人們的重視。
　　 本研究旨在通過制備赭曲霉毒素A單克隆抗體，并對(duì)此進(jìn)行初步鑒定，為今后檢測(cè)食品中OTA的殘留提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

2、
　　 方法:1、將OTA與牛血清白蛋白(BSA)的偶聯(lián)產(chǎn)物（購(gòu)自sigma公司）用10 mM磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋成1ug/ul備用。采用碳二亞胺法將OTA偶聯(lián)到血藍(lán)蛋白（KLH），紫外吸收和ELISA測(cè)定偶聯(lián)產(chǎn)物以確定是否偶聯(lián)成功。
　　 2、采用小劑量長(zhǎng)周期的免疫方案，OTA-BSA偶聯(lián)產(chǎn)物免疫雌性B ABL/c小鼠，分別以BSA、OTA-KLH作為包被抗原，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)小鼠血清中抗體的效

3、價(jià)，選取效價(jià)最高的小鼠取脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合，以O(shè)TA-KLH作為包被抗原，以BSA作對(duì)照，ELISA檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞上清中的抗體，獲得分泌抗OTA的雜交瘤細(xì)胞株，有限稀釋法對(duì)分泌抗OTA雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化，ELISA確定抗體的特異性，并獲得單克隆細(xì)胞株。腹水誘生法大量制備抗OTA的單克隆抗體，并以ELISA檢測(cè)腹水效價(jià)，同時(shí)以BSA、KLH作包被抗原對(duì)照，觀察有無交叉反應(yīng)。
　　 結(jié)果:小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/O)

4、與小鼠脾細(xì)胞細(xì)胞融合后，ELISA篩選抗體分泌陽(yáng)性且與BSA反應(yīng)呈陰性的雜交瘤細(xì)胞株，對(duì)分泌抗OTA特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行4輪克隆化，抗體陽(yáng)性率達(dá)到了100％，建立了2株能穩(wěn)定分泌抗OTA抗體的單克隆雜交瘤細(xì)胞株，命名為2D8和3G11。腹水誘生法制備了大量的單克隆抗體，腹水抗體效價(jià)分別為:1∶102400和1∶51200，而且與BSA和KLH無交叉反應(yīng)。通過間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法的評(píng)價(jià)，2D8檢測(cè)下限為0.16 ng/ml，半抑制