抗PSMA多肽單克隆抗體的制備、鑒定和初步應(yīng)用.pdf

1、[目的]前列腺癌是一種高發(fā)的惡性腫瘤，其早期診斷和及時治療對前列腺癌患者的預(yù)后有非常重要的臨床意義。PSMA是新近發(fā)現(xiàn)的前列腺癌相關(guān)抗原，具有良好的組織特異性，使它成為最具診斷和靶向治療價值的癌標(biāo)?？筆SMA的單克隆抗體因其獨(dú)特的優(yōu)勢越來越顯示出它的臨床應(yīng)用價值和前景。本實(shí)驗(yàn)旨在用合成多肽抗原制備抗PSMA單克隆抗體，為建立免疫學(xué)和血清學(xué)檢測方法和PSMA的功能研究奠定基礎(chǔ)，并可在此基礎(chǔ)上制備人源化抗體，為前列腺癌的放射顯像診斷和免疫導(dǎo)

2、向治療提供物質(zhì)基礎(chǔ)，對前列腺癌的診斷和治療有著重要意義。 [方法] 以PSMA的氨基酸序列為基礎(chǔ)，找出符合條件的優(yōu)勢B細(xì)胞表位序列并對所獲得的表位進(jìn)行計算機(jī)分子建模，設(shè)計2段12個氨基酸長的短肽，用固相化學(xué)合成法人工合成。為增強(qiáng)免疫原性，在多肽的C-端分別接上一個Cys，用馬來酸亞胺活化法與鑰孔鏚血藍(lán)素(KLH)或牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)構(gòu)成免疫原，多肽-KLH偶聯(lián)復(fù)合物用于免疫BALB/c小鼠，多肽-BSA偶聯(lián)復(fù)合物

3、用于間接ELISA法檢測小鼠血清和雜交瘤細(xì)胞上清及腹水的抗體效價。用多肽-KLH偶聯(lián)復(fù)合物免疫BALB/c小鼠，三次免疫，免疫效果用免疫熒光法和ELISA法檢測。采用PEG法，取免疫效價高的脾細(xì)胞與來自同系小鼠的骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合。用HAT選擇培養(yǎng)基篩選融合細(xì)胞，克隆生長孔用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和免疫熒光法監(jiān)測上清抗體效價，篩選出抗PSMA陽性克隆。陽性克隆經(jīng)過4次有限稀釋法克隆化培養(yǎng)得到2株均一的穩(wěn)定分泌抗PSMAmAb

4、的雜交瘤細(xì)胞株。將雜交瘤細(xì)胞注入經(jīng)降植烷預(yù)處理的BALB/c小鼠腹腔制備腹水型mAb，并對其進(jìn)行了鑒定分析，包括免疫球蛋白類別及亞型鑒定、特異性的鑒定、敏感性鑒定、相對親和力鑒定、抗原結(jié)合位點(diǎn)測定、耐凍融性測定、熱穩(wěn)定性測定、不同pH值條件對單抗穩(wěn)定性影響的測定。采用簡便、快速的飽和硫酸銨粗提法純化腹水，用SDS-PAGE進(jìn)行分析，并用Westernblotting法檢測相應(yīng)PSMA蛋白。利用免疫組化法鑒定制備的mAb，且初步應(yīng)用于檢測

5、前列腺癌、良性前列腺增生組織PSMA的分布。 [結(jié)果] 獲得兩株可穩(wěn)定分泌PSMA單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，4F4為IgG1類，1F1為IgG3類。兩株單抗均能識別LNCap細(xì)胞的PSMA蛋白，與不表達(dá)PSMA的PC-3細(xì)胞，BIU，Hela等細(xì)胞無交叉反應(yīng)；雜交瘤細(xì)胞株1F1培養(yǎng)上清效價為1∶40，腹水效價為1∶6400；而雜交瘤細(xì)胞株4F4培養(yǎng)上清效價為1∶80，腹水效價為1∶8000；2株mAb的相對親和力為mAb

6、4F4株＞mAb1F1株；ELISA單抗相加實(shí)驗(yàn)示AI＞50％表明兩抗體針對不同的抗原決定簇；兩株mAb耐凍融性強(qiáng)，4F4較1F1耐熱性好，且在中性條件和偏堿性條件下穩(wěn)定，而在酸性條件下不穩(wěn)定；用飽和硫酸銨粗提法純化的mAb純度高，操作簡便、快速，SDS-PAGE電泳分析結(jié)果，重鏈分子量約52KD，輕鏈分子量約為20KD；用Westernblotting法可檢測出100KD的PSMA蛋白。經(jīng)免疫組化可知此單抗能特異性和組織中PSMA結(jié)合

7、，且前列腺癌組織染色強(qiáng)度、范圍與正常前列腺和前列腺增生組織存在明顯差異。 [結(jié)論] 1.利用合成肽抗原，成功建立了2株能穩(wěn)定分泌針對不同抗原表位的抗PSMA單抗的雜交瘤細(xì)胞株。 2.免疫熒光證實(shí)該2株單抗能識別天然PSMA蛋白，Western-blot證實(shí)其具有PSMA的高度特異性，顯示了廣泛的應(yīng)用前景。 3.已鑒定出該2株單抗的基本特性，為其開發(fā)和應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)參數(shù)和依據(jù)。 4.應(yīng)用免疫組化，初步