NY-ESO-1單克隆抗體的制備、鑒定及初步應(yīng)用.pdf

1、目的：在惡性腫瘤特異性診斷治療中，廣譜癌基因以其潛在的應(yīng)用價(jià)值成已成為應(yīng)用研究熱點(diǎn)。在診斷應(yīng)用中，利用單克隆抗體檢測腫瘤特異抗原成為臨床診斷的重要組成部分，同時(shí)應(yīng)用腫瘤特異性抗原激活抗原提呈細(xì)胞進(jìn)行免疫治療，也正在成為重要的腫瘤輔助治療手段，腫瘤抗原已經(jīng)成為目前的研究熱點(diǎn)。NY-ESO一1抗原是近年發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤特異性抗原，屬于癌癥睪丸抗原(CTA)家族。NY-ESO-l，在正常組織只表達(dá)于睪丸、胎盤(這些組織由于不表達(dá)MHC—I類分子

2、，不能成為免疫攻擊的目標(biāo)，屬于免疫特權(quán)部位能得以免疫豁免)，在腫瘤組織中NY-ESO一1抗原廣泛表達(dá)。通過基因克隆制備人NY-ESO一1全基因，并將其構(gòu)建于表達(dá)載體PGEX-4~2中，得到重組表達(dá)載體PGEX-4T-2／NY-ESO-1，將PGEX-4T-2／NY-ESO一1轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，得到的融合蛋白經(jīng)純化后進(jìn)行動物免疫，制備多克隆抗體，通過建立NY-ESO-1單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞系，制備抗NY-ESO-1單克隆

3、抗體，確定其免疫學(xué)特性后，用于檢測NY-ESO一1在乳癌中的表達(dá)，判斷NY-ESO—l與乳癌的發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系。 方法：將人黑色素瘤NY-ESO一1重組表達(dá)載體PGEX-4T-2／NY-ESO-1(本室保存)轉(zhuǎn)化的BL21大腸桿菌，通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，獲得可溶性融合蛋白。融合蛋白經(jīng)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶親和層析柱純化，免疫Balb／c小鼠。用傳統(tǒng)方法進(jìn)行細(xì)胞融合后，采用本室改良的細(xì)胞篩選方法制備了鼠抗人單克隆抗體，并對得到的

4、單克隆抗體進(jìn)行了特異性、亞類和亞型等的鑒定。對乳癌組織進(jìn)行免疫組化，檢測NY-ESO一1的蛋白表達(dá)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。 結(jié)果：成功誘導(dǎo)表達(dá)PGEX-4％2／NY-ESO-1轉(zhuǎn)化的BL21大腸桿菌，得到純度>90％的GST-NY-ESO-1蛋白，進(jìn)行牛凝血酶切割后，得到純化的NY-ESO一1蛋白。成功免疫Balb／c小鼠，得到血清效價(jià)1：20000的小鼠。進(jìn)行傳統(tǒng)細(xì)胞融合后，進(jìn)行ELISA篩選，篩選出高效價(jià)的兩株單克隆抗體，經(jīng)Wester

5、nblotting鑒定單抗與NY-ESO-1特異性反應(yīng)，與菌體蛋白不反應(yīng)，特異性較強(qiáng)。兩株單抗的輕鏈均為K，重鏈均為IgG2b。RT-PCR法檢測23例乳癌新鮮組織標(biāo)本NY-ESO-1基因的表達(dá)，結(jié)果顯示有8例標(biāo)本表達(dá)NY-ESO-1，表達(dá)率可達(dá)34．8％。本室制備的NY-ESO-1單抗進(jìn)行乳癌免疫組化，結(jié)果顯示檢出率可達(dá)25％。 結(jié)論： 1、得到純化的NY-ESO-1蛋白，為制備有效的腫瘤疫苗尤其是聯(lián)合多價(jià)疫苗進(jìn)行腫瘤

6、免疫治療奠定了基礎(chǔ)。 2、得到高效價(jià)多抗，應(yīng)用本室改良的雜交瘤細(xì)胞篩選技術(shù)成功制備了高效價(jià)的抗NY-ESO一1單克隆抗體，經(jīng)檢測具有高特異性和親和力，為腫瘤診斷提供了重要手段，為深入研究NY-ESO-1的表達(dá)及臨床應(yīng)用提供了重要工具。 3、用RT-PCR法、IHC法檢測乳癌組織，結(jié)果顯示NY-ESO-1在浸潤性乳癌中表達(dá)高于原位癌，并且乳癌組織中NY-ESO-1的表達(dá)與臨床病理組織分級之間成正相關(guān)，組織分級越高NY-ES