NY-ESo-1的原核表達(dá)、抗體制備及其鑒定.pdf

1、目的:構(gòu)建腫瘤-睪丸抗原NY-ESO-1與GST融合基因的原核表達(dá)載體，制備其單克隆抗體及多克隆抗體并進(jìn)行初步鑒定，通過Westen-blot檢測(cè)其特異性，利用免疫組化研究其在腫瘤治療上的應(yīng)用價(jià)值。
　　方法:
　　1、目的基因的獲得及重組表達(dá)載體的構(gòu)建
　　設(shè)計(jì)針對(duì)NY-ESO-1的特異性引物，采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)從睪丸組織的cDNA文庫(kù)擴(kuò)增NY-ESO-1基因片段，經(jīng)上下游引物所引入的EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶

2、切后克隆入原核表達(dá)載體pGEX-4T1中GST標(biāo)簽的下游，構(gòu)建重組表達(dá)載體pGEX-4T1-NY-ESO-1。
　　2、細(xì)菌培養(yǎng)
　　將載體pGEX-4T1-NY-ESO-1轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3) pLysS中，進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。
　　3、目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及鑒定
　　用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)NY-ESO-1/GST融合蛋白，經(jīng)不同濃度尿素洗脫純化后，表達(dá)產(chǎn)物通過SDS-PAGE和Western blot法鑒

3、定獲得NY-ESO-1/GST融合蛋白。
　　4、單克隆抗體制備
　　用NY-ESO-1/GST融合蛋白免疫BALB/c小鼠，采用傳統(tǒng)方法制備抗NY-ESO-1單克隆抗體，通過細(xì)胞融合，HAT選擇，有限稀釋法克隆擴(kuò)增，獲得NY-ESO-1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
　　5、多克隆抗體制備
　　將NY-ESO-1/GST融合蛋白免疫家兔制備NY-ESO-1多抗血清，獲得NY-ESO-1多克隆抗體。
　　6、抗

4、體的鑒定及免疫組化
　　通過間接ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)，Western-blot檢測(cè)其的特異性。利用免疫組化技術(shù)研究其在正常睪丸組織和癌組織檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值。
　　結(jié)果:重組質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定和IPTG誘導(dǎo)表達(dá)NY-ESO-1/GST的SDS-PAGE分析表明，表達(dá)產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)為44000，與理論值相符，并主要以包涵體形式存在，Western blot結(jié)果證實(shí)該NY-ESO-1/

5、GST可與抗GST單克隆抗體(mAb)發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，提示為融合蛋白。通過單克隆抗體的制備，免疫獲得了1株抗NY-ESO-1單克隆抗體細(xì)胞株，經(jīng)過間接EL1SA檢測(cè)，抗體效價(jià)為10-7，經(jīng)Westem blot和免疫組化等鑒定，抗體的特異性良好，與載體蛋白GST無交叉反應(yīng)。免疫家兔后獲得高效價(jià)NY-ESO-1抗血清，Westem blot檢測(cè)證實(shí)該血清特異性較好。通過免疫組化技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示可見其目的基因在正常睪丸組織和癌組織中均有