剛地弓形蟲(chóng)GRA17、GRA23核酸疫苗及GRA17缺失株弱毒活疫苗的免疫保護(hù)性研究.pdf

1、弓形蟲(chóng)?。═oxoplasmosis）是一種由弓形蟲(chóng)感染引起的重要的人獸共患的寄生蟲(chóng)病。弓形蟲(chóng)可以感染幾乎所有的溫血?jiǎng)游铮òㄈ耍?，人類弓形蟲(chóng)的感染率達(dá)到了三分之一左右，弓形蟲(chóng)病傳染性很強(qiáng)，并且流行也非常廣泛。目前尚無(wú)穩(wěn)定、安全、有效的弓形蟲(chóng)疫苗可用，因而研發(fā)高效的新型疫苗成為防控弓形蟲(chóng)病的首要任務(wù)。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)不斷的創(chuàng)新和提高，弓形蟲(chóng)的基因疫苗作為可能用于預(yù)防弓形蟲(chóng)病的重要方式之一，其相關(guān)研究也越來(lái)越引起人們的重視?；蛞呙缇哂忻?/p>

2、疫保護(hù)力強(qiáng)、免疫持久、穩(wěn)定性好、制備簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低等諸多優(yōu)點(diǎn)。
　　弓形蟲(chóng)的致密顆粒蛋白是由顆粒細(xì)胞器分泌的一類免疫活性蛋白，它們?cè)诠蜗x(chóng)的細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，是重要的疫苗候選分子。有關(guān)研究表明，弓形蟲(chóng)GRA17基因的缺失能夠使蟲(chóng)體喪失毒力，這為我們對(duì)GRA17和GRA23基因的核酸疫苗及GRA17基因缺失株弱毒苗的研究奠定了基礎(chǔ)。本研究旨在構(gòu)建弓形蟲(chóng)GRA17基因的DNA疫苗及GRA17基因缺失株弱毒苗，評(píng)

3、價(jià)其抗弓形蟲(chóng)的免疫保護(hù)力。利用RT-PCR技術(shù)從RH株弓形蟲(chóng)速殖子總RNA中擴(kuò)增得到弓形蟲(chóng)TgGRA17和TgGRA23基因，構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX-GRA17和pVAX-GRA23；然后將質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到HEK293-T細(xì)胞中，并對(duì)基因在細(xì)胞中的表達(dá)情況進(jìn)行鑒定分析。利用重組質(zhì)粒pVAX-GRA17、pVAX-GRA23及pVAX-GRA17+pVAX-GRA23的混合疫苗組對(duì)BABL/c小鼠先后進(jìn)行三次免疫，以空質(zhì)粒pVAX1作為

4、對(duì)照；在第3次免疫之后2 w和每次免疫之前收集小鼠血清，利用ELISA方法對(duì)小鼠血清中的IgG抗體水平進(jìn)行檢測(cè)。在第三次免疫2w后，每組取3只小鼠，將小鼠安樂(lè)死之后取脾臟，制備脾淋巴細(xì)胞懸液；利用CCK-8法對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖能力進(jìn)行檢測(cè)，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞百分比。利用弓形蟲(chóng)速殖子抗原（STAg）刺激小鼠脾細(xì)胞，通過(guò)ELISA檢測(cè)試劑盒對(duì)脾細(xì)胞因子進(jìn)行檢測(cè)。三次免疫之后，對(duì)小鼠進(jìn)行攻蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)基因疫苗

5、對(duì)小鼠的免疫保護(hù)力。利用CRISPR/Cas9技術(shù)在Ⅰ型RH蟲(chóng)株中敲除了GRA17基因，成功構(gòu)建RHΔGRA17蟲(chóng)株，并利用RHΔGRA17蟲(chóng)株感染昆明小鼠，分別在免疫28 d和70 d之后收集小鼠血清，利用ELISA方法對(duì)小鼠血清中的IgG抗體水平進(jìn)行檢測(cè)。并在免疫70 d之后每組取三只小鼠安樂(lè)死之后取脾臟，制備脾淋巴細(xì)胞懸液，利用弓形蟲(chóng)速殖子抗原刺激小鼠脾細(xì)胞，通過(guò)ELISA檢測(cè)試劑盒
　　對(duì)脾細(xì)胞因子進(jìn)行檢測(cè)。在免疫70 d

6、后對(duì)小鼠進(jìn)行攻蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)RHΔGRA17蟲(chóng)株對(duì)小鼠的免疫保護(hù)力。
　　GRA17和GRA23基因疫苗實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，疫苗免疫組IgG抗體水平隨著時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高，且混合基因疫苗組的抗體水平高于單基因疫苗組。脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示， pVAX-GRA17、pVAX-GRA23和pVAX-GRA17+pVAX-GRA23混合疫苗免疫組的SI值分別為1.24±0.13，1.54±0.11，1.57±0.085；CD

7、4+T細(xì)胞百分比分別為21.49±1.68，21.23±3.89，20.34±1.88；CD8+T細(xì)胞百分比分別為6.66±1.02，7.63±1.24，8.20±0.97。與對(duì)照組相比以上數(shù)據(jù)都有一定程度的升高。經(jīng)致死性RH株弓形蟲(chóng)感染后，pVAX-GRA17、pVAX-GRA23及pVAX-GRA17+pVAX-GRA23的混合疫苗組小鼠存活時(shí)間分為9.1±0.32 d、10.8±0.79 d和12.6±2.55 d，與對(duì)照組相比均

8、有明顯增長(zhǎng)。說(shuō)明 pVAX-GRA17、pVAX-GRA23和pVAX-GRA17+pVAX-GRA23能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生一定水平的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，并對(duì)弓形蟲(chóng)感染產(chǎn)生了一定程度的免疫保護(hù)力，且混合疫苗與單基因疫苗相比具有更好的免疫保護(hù)效果。
　　RHΔGRA17蟲(chóng)株弱毒苗研究結(jié)果顯示，RHΔGRA17弱毒蟲(chóng)株能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答。弓形蟲(chóng)急性感染試驗(yàn)中，空白對(duì)照組小鼠感染弓形蟲(chóng)RH、PYS和TgC7

9、蟲(chóng)株后，小鼠再感染10 d之內(nèi)全部死亡；而經(jīng)RHΔGRA17蟲(chóng)株免疫的小鼠能感染弓形蟲(chóng)RH、PYS和TgC7株速殖子后，35 d之內(nèi)均無(wú)死亡現(xiàn)象。弓形蟲(chóng)慢性感染試驗(yàn)中，空白對(duì)照組感染弓形蟲(chóng)PRU株包囊后，小鼠在感染35 d后僅有40％的小鼠存活，且存活小鼠的腦包囊鼠為4296±687個(gè)/只；而經(jīng)RHΔGRA17弱毒苗免疫的小鼠分別感染弓形蟲(chóng)PRU株包囊后，小鼠在感染35 d之內(nèi)均無(wú)死亡現(xiàn)象，且存活小鼠的腦包囊鼠為53±15個(gè)/只。以上結(jié)