弓形蟲MORN1-2基因缺失株的構(gòu)建及其免疫保護性研究.pdf

1、剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）是一種專性細胞內(nèi)寄生原蟲，可以感染幾乎所有的溫血動物，引起嚴重的弓形蟲病癥，造成新生兒流產(chǎn)、死胎等。弱毒活疫苗對控制弓形蟲的傳播有潛在價值，但報道甚少。MORN基因家族因參與速殖子細胞骨架的形成過程而發(fā)揮重要作用，是作為研制抗弓形蟲弱毒活疫苗的理想候選基因。本研究的目的在于構(gòu)建弓形蟲MORN1與MORN2基因缺失株，闡明MORN基因家族成員的在弓形蟲中的生物學功能，評價它們作為弱毒活疫苗的

2、免疫保護力，探究其作為弱毒活疫苗的潛在價值。
　　首先，為研究MORN2基因的生物學功能是否與弓形蟲的毒力相關(guān)，我們利用CRISPR/Cas9技術(shù)，對弓形蟲Ⅰ型RH蟲株的MORN2基因進行了敲除。利用同源重組，在基因缺失處插入乙胺嘧啶藥物抗性的片段DHFR。通過單克隆篩選以及PCR鑒定，成功獲得MORN2基因缺失株。對該缺失株進行體外噬斑試驗和體內(nèi)毒力試驗后，發(fā)現(xiàn)MORN2基因的缺失幾乎不影響RH蟲株在體外培養(yǎng)時的生長速度和對小鼠

3、感染的毒力。因此我們認為MORN2基因的缺失不影響弓形蟲RH蟲株的毒力，其缺失株不具備成為弱毒疫苗的可能性。
　　然后，為了研究△MORN1弱毒株作為弱毒疫苗的潛在可能性，我們又構(gòu)建了△MORN1缺失株，評價了該缺失株對小鼠的毒力影響。進而以△MORN1缺失株腹腔接種昆明鼠，并在免疫后28d和70d檢測相應的體液免疫和細胞免疫指標變化情況。在免疫70d后進行攻蟲實驗，對免疫的小鼠通過腹腔注射的方式，分別感染RH、PYS及TgC7三

4、種不同蟲株的速殖子103個（急性感染）或通過口服的萬式感染PRU包囊20個（慢性感染），檢測小鼠的存活時間和包囊減少率。結(jié)果表明，經(jīng)△MORN1缺失株免疫的小鼠血清中抗體水平顯著升高，脾細胞產(chǎn)生的細胞因子水平顯著升高。在急性感染試驗中，免疫鼠夠較好地抵御RH、PYS及TgC7三種蟲株的感染。在慢性感染試驗中，對PRU包囊造成的慢性感染有較好的保護作用，能夠有效減少小鼠腦中包囊數(shù)量。為了探究△MORN1缺失株對弓形蟲垂直傳播（先天性感染）

5、的阻斷效果，分別在母鼠懷孕第12天和第18天時，口服感染PRU蟲株的包囊10個或者腹腔注射RH蟲株速殖子200個，觀察并記錄仔鼠存活數(shù)和體重變化。結(jié)果顯示經(jīng)△MORN1缺失株免疫的母鼠能夠明顯地提高仔鼠的存活率及體重，同時減少仔鼠腦中包囊數(shù)量?！鱉ORN1缺失株能夠?qū)π∈蟮募毙愿腥尽⒙愿腥炯跋忍煨愿腥揪哂斜Ｗo作用，因此有望成為防控弓形蟲病的弱毒疫苗。
　　綜上所述，本研究通過構(gòu)建弓形蟲Ⅰ型RH蟲株的△MORN1與△MORN2缺失