弓形蟲入侵相關(guān)蛋白MIC3的定位及其保護(hù)性研究.pdf

1、研究目的： (1) 觀察微線體蛋白在弓形蟲速殖子內(nèi)的分布。 (2)觀察弓形蟲微線體MIC3DNA疫苗的免疫保護(hù)效果。 研究方法： (1)采用RT-PCR法從弓形蟲RH株擴(kuò)增出微線體分泌蛋白MIC3編碼基因，亞克隆至真核表達(dá)載體，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-MIC3和綠色熒光表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C2-MIC3。 (2)利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別轉(zhuǎn)染真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-MIC3和pEGFP-C2-M

2、IC3入體外培養(yǎng)的COS-7細(xì)胞，獲得重組蛋白，并通過SDS-PAGE和Western-blot等方法鑒定其表達(dá)；以熒光蛋白EGFP為標(biāo)志觀察MIC3在真核細(xì)胞中的定位。 (3)利用電穿孔法轉(zhuǎn)染pEGFP-C2-MIC3入弓形蟲體內(nèi)，通過EGFP的表達(dá)示蹤觀察MIC3在蟲體內(nèi)的定位。 (4)大量制備并純化重組質(zhì)粒pcDNA3-MIC3，采用肌肉注射法免疫小鼠后進(jìn)行攻擊感染，觀察小鼠死亡時(shí)間、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、特異血清抗體和

3、脾淋巴細(xì)胞亞群中CD4+和CD8+比值等，以期闡明對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的影響。 研究結(jié)果： (1)成功構(gòu)建重組質(zhì)粒的pcDNA3-MIC3和pEGFP-C2-MIC3，DNA序列測(cè)定結(jié)果表明將大小為1080bp的MIC3片段分別克隆到pcDNA3的Hind Ⅲ/EcoR Ⅴ位點(diǎn)和pEGFP-C2的BgL Ⅱ/HidnⅢ。 (2)轉(zhuǎn)染pcDNA3-MIC3入COS-7細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果顯示42KD

4、a大小的條帶，Western-blot和ELISA進(jìn)一步證實(shí)MIC3蛋白具有免疫學(xué)活性。 (3)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染pEGFP-C2-MIC3入COS-7細(xì)胞表達(dá)后的MIC3-EGFP融合蛋白呈點(diǎn)狀分布均勻地分布COS-7細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中并在核膜附近有強(qiáng)綠色熒光的聚集，聚集的形狀象英文字母“C”，而在細(xì)胞核內(nèi)和細(xì)胞膜上沒有發(fā)現(xiàn)MIC3-EGFP融合蛋白的表達(dá)。通過電穿孔法轉(zhuǎn)染pEGFP-C2-MIC3入弓形蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，熒光集中于蟲體頂端，

5、說明MIC3能夠靶向蟲體頂端細(xì)胞器。 (4)DNA疫苗免疫動(dòng)物顯示，pcDNA3-MIC3能延長(zhǎng)弓形蟲RH株攻擊感染的生存時(shí)間。同時(shí)，對(duì)免疫鼠研究發(fā)現(xiàn)，pcDNA3-MIC3能刺激機(jī)體產(chǎn)生較高水平的特異性抗體；pcDNA3-MIC3能使宿主脾細(xì)胞CD4+/CD8+比值下降，與對(duì)照組相比，P值均小于0.05。提示該DNA疫苗主要以CD8+的CTL細(xì)胞途徑激發(fā)機(jī)體的抗弓形蟲效應(yīng)。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建了兩個(gè)真核表達(dá)質(zhì)

6、粒pcDNA3-MIC3和pEGFP-C2-MIC3 2.pcDNA3-MIC3成功地轉(zhuǎn)化入COS-7細(xì)胞，并獲得真核表達(dá)的MIC3蛋白，經(jīng)Western-blot和ELISA分析顯示重組MIC3有特異性的免疫原性。 3.pEGFP-C2-MIC3成功轉(zhuǎn)染入COS-7細(xì)胞顯示MIC3定位于真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，轉(zhuǎn)染入弓形蟲體內(nèi)結(jié)果顯示MIC3能能夠靶向蟲體頂端細(xì)胞器。 4.成功構(gòu)建MIC3的DNA疫苗，動(dòng)物結(jié)果顯示其