CaM在弓形蟲(chóng)入侵過(guò)程中的機(jī)制研究.pdf

1、頂復(fù)門(mén)寄生蟲(chóng)是一類(lèi)嚴(yán)格的胞內(nèi)寄生生物，對(duì)人和動(dòng)物會(huì)造成嚴(yán)重的疾病。頂復(fù)門(mén)寄生蟲(chóng)的模式生物之一——?jiǎng)偟毓蜗x(chóng)(Toxoplasma gondii)，全球大約有超過(guò)三分之一的人口被其所感染，免疫能力低下的個(gè)體和新生兒甚至?xí)艿缴耐{。弓形蟲(chóng)擁有如此廣泛的宿主范圍與它強(qiáng)大的入侵機(jī)制有密切的關(guān)系。鈣離子作為細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，調(diào)控著弓形蟲(chóng)多個(gè)生命活動(dòng)，尤其是蟲(chóng)體入侵和逸出過(guò)程。而鈣離子信號(hào)通路發(fā)揮作用需要依賴(lài)于各類(lèi)鈣離子相關(guān)蛋白，但是目前

2、對(duì)于這些鈣相關(guān)蛋白知之甚少，它們之間的關(guān)系也尚不清楚，鑒定它們?cè)阝}離子信號(hào)通路中的作用，以及它們的互作關(guān)系可以進(jìn)一步解釋弓形蟲(chóng)的入侵機(jī)制，為藥物靶標(biāo)的篩選提供依據(jù)。
　　本研究以鈣調(diào)蛋白(簡(jiǎn)稱(chēng)CaM)為研究對(duì)象，利用CRISPR/Cas9和Cre-LoxP系統(tǒng)對(duì)CaM在RH△HX蟲(chóng)株中進(jìn)行敲除，比較CaM基因敲除蟲(chóng)株和RH△HX蟲(chóng)株在復(fù)制能力和入侵能力上的差異;同時(shí)，利用BioID技術(shù)，篩選CaM的互作蛋白，試圖發(fā)現(xiàn)更多的鈣離子信

3、號(hào)通路中的功能蛋白。具體實(shí)驗(yàn)內(nèi)容如下:
　　(1) CaM蛋白原核表達(dá)和多克隆抗體的制備。構(gòu)建pGEX-KG-CaM原核表達(dá)質(zhì)粒，該質(zhì)粒在表達(dá)感受態(tài)BL21(DE3)中能夠順利表達(dá)，將表達(dá)的蛋白純化后進(jìn)行動(dòng)物免疫，收集免疫后的動(dòng)物血清，用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)抗體效價(jià)，結(jié)果顯示該多克隆抗體具有較高水平的抗體效價(jià)。
　　(2) RH△HX-LoxP-CaM蟲(chóng)株的構(gòu)建。利用Cre-LoxP系統(tǒng)對(duì)CaM基因的條件性敲除。首先，構(gòu)建能夠

4、識(shí)別CaM基因座的pSAG1∷Cas9-U6∷sgCaM的CRISPR質(zhì)粒和同源替換的模板質(zhì)粒pUC19-CaM-YFP，然后將擴(kuò)增出來(lái)的同源替換片段和pSAG1∷Cas9-U6∷sgCaM質(zhì)粒共同電轉(zhuǎn)到RH△HX蟲(chóng)株的速殖子中，用黃嘌呤和霉酚酸進(jìn)行藥物篩選，再通過(guò)限制性稀釋的方法進(jìn)行單克隆的篩選，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后用PCR和IFA進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示成功獲得RH△HX-LoxP-CaM蟲(chóng)株。
　　(3) CaM敲除株表型研究。在RH△H

5、X-LoxP-CaM蟲(chóng)株的基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)染能夠表達(dá)Cre剪切酶的質(zhì)粒pmin-eGFP-Cre對(duì)CaM基因進(jìn)行剪切，從而實(shí)現(xiàn)CaM的缺失。將CaM的缺失株與RH△HX蟲(chóng)株同時(shí)進(jìn)行胞內(nèi)復(fù)制實(shí)驗(yàn)和入侵實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)缺失株和RH△HX蟲(chóng)株在胞內(nèi)的復(fù)制能力沒(méi)有多大的差異;但是缺失株的入侵能力有明顯缺陷，入侵能力較RH△HX蟲(chóng)株顯著性下降。
　　(4) BioID技術(shù)篩選與CaM的互作蛋白。用生物素標(biāo)記經(jīng)過(guò)遺傳改造后的蟲(chóng)株RH△HX-BirA*-C

6、aM和原始蟲(chóng)株RH△HX，經(jīng)過(guò)24h的作用后，通過(guò)間接熒光免疫和Western-blot檢測(cè)到RH△HX-BirA*-CaM蟲(chóng)株有被生物素標(biāo)記上的特異蛋白，為了進(jìn)一步確定這些蛋白，進(jìn)行了質(zhì)譜分析。經(jīng)過(guò)質(zhì)譜結(jié)果的分析對(duì)比，從本實(shí)驗(yàn)得到25個(gè)特異性的蛋白質(zhì)。對(duì)鑒定到的這些蛋白質(zhì)進(jìn)行功能和定位的分析，推測(cè)內(nèi)膜復(fù)合物(IMC)和果糖1，6-二磷酸醛縮酶與CaM存在互作的可能性，但它們之間具體的關(guān)系還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
　　本研究主要利用