細(xì)胞Rho和Rac GTP酶在剛地弓形蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞過(guò)程中的作用研究.pdf

1、剛地弓形蟲(chóng)(Toxoplasma gondii)是細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲(chóng)，能感染多種有核細(xì)胞，全世界約有三分之一的人口隱性感染弓形蟲(chóng)。弓形蟲(chóng)感染人體后，在免疫正常人群可由急性感染快速地轉(zhuǎn)為隱性感染，因而危害不明顯;而在免疫抑制患者體內(nèi)會(huì)廣泛散播，寄生于有核細(xì)胞引起炎癥，弓形蟲(chóng)主要損害腦、眼和淋巴結(jié)，甚至?xí)鹚劳?在孕婦感染后，弓形蟲(chóng)可通過(guò)胎盤(pán)傳播給胎兒，造成流產(chǎn)、死產(chǎn)、死胎、畸胎或新生兒弓形蟲(chóng)病。人類(lèi)感染弓形蟲(chóng)的途徑主要是通過(guò)誤食未煮熟的中間

2、宿主的肉或被終宿主（貓）排泄的卵囊污染的食物。
　　 弓形蟲(chóng)感染宿主后會(huì)刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)以抵抗弓形蟲(chóng)感染，在感染早期，細(xì)胞免疫反應(yīng)在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮主要抗感染作用。免疫的形成雖可有效地限制感染的發(fā)展和新?lián)p傷的形成，但一般并不能消除弓形蟲(chóng)感染。多數(shù)研究者認(rèn)為，弓形蟲(chóng)具有帶蟲(chóng)免疫的特點(diǎn)。機(jī)體只在感染過(guò)程中才對(duì)再感染具有一定程度的抵抗力，而蟲(chóng)體清除后該種免疫力也消失。弓形蟲(chóng)可以在機(jī)體免疫反應(yīng)環(huán)境中保持存活，主要是通過(guò)在弓形蟲(chóng)納蟲(chóng)泡內(nèi)保持

3、良好增殖和干擾宿主細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式進(jìn)行的，但宿主免疫反應(yīng)只能被部分削弱，而不是完全被消除。弓形蟲(chóng)通過(guò)在誘導(dǎo)和抑制宿主免疫反應(yīng)過(guò)程中保持著精致平衡，來(lái)保證在宿主細(xì)胞內(nèi)寄生、增殖并有機(jī)會(huì)傳播。弓形蟲(chóng)入侵和寄生過(guò)程中有許多宿主細(xì)胞信號(hào)通路的參與并出現(xiàn)廣泛變化，在弓形蟲(chóng)入侵、寄生、增殖及與弓形蟲(chóng)-宿主細(xì)胞相互關(guān)系中起著重要的作用。
　　 弓形蟲(chóng)感染宿主細(xì)胞的機(jī)制已被廣泛研究，在弓形蟲(chóng)入侵時(shí)，速殖子是弓形蟲(chóng)的主要致病蟲(chóng)期，其在細(xì)胞內(nèi)寄生

4、和迅速繁殖破壞宿主細(xì)胞，逸出后的裂殖子又侵襲鄰近的細(xì)胞，如此反復(fù)，刺激淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，導(dǎo)致組織的急性炎癥和壞死。弓形蟲(chóng)侵入細(xì)胞的過(guò)程依次為:附著于宿主細(xì)胞;伸出類(lèi)錐體;進(jìn)入宿主細(xì)胞;蟲(chóng)體向后移動(dòng)的運(yùn)動(dòng)連接(moving junction，MJ)形成;微線(xiàn)體的分泌作用;棒狀體的分泌作用;蟲(chóng)體滑入納蟲(chóng)空泡，在10s內(nèi)完成整個(gè)侵入過(guò)程，蟲(chóng)體進(jìn)入胞漿后運(yùn)動(dòng)較為緩慢，并且有向核移動(dòng)的特性。在弓形蟲(chóng)侵入宿主細(xì)胞過(guò)程中會(huì)形成納蟲(chóng)泡(PV)，

5、在這個(gè)過(guò)程中，MJ會(huì)清除宿主細(xì)胞的一些組分（如跨膜蛋白），同時(shí)保留大部分的宿主細(xì)胞膜組分組成到納蟲(chóng)泡膜(PVM)上，此外因宿主細(xì)胞膜中能與溶酶體和內(nèi)涵體融合的組分已被MJ過(guò)濾掉，使PV成為一個(gè)非融合小室，有助于其內(nèi)的速殖子抵抗宿主細(xì)胞內(nèi)含體的融合及溶酶體的酸化作用。
　　 GTP酶(GTPase)是能夠與三磷酸鳥(niǎo)苷(GTP)結(jié)合并在Mg2+作用下將其水解為二磷酸鳥(niǎo)苷(GDP)的超蛋白家族。小分子GTP酶是相對(duì)分子質(zhì)量為20 kD

6、a-40 kDa的單體調(diào)控性GTP酶，至少由5個(gè)家族組成，分別是:Ras、Rho、Rab、Sar1/Arf和Ran。目前研究較多的為Ras和Rho家族。其中Rho族蛋白主要包括Rho、Rac和Cdc42三個(gè)亞家族，這些蛋白最主要的功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架和肌動(dòng)蛋白重組，其他功能包括調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期和膜泡運(yùn)輸?shù)取?br>　　 Rho GTP酶最主要的功能是調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白和細(xì)胞骨架的重組，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的形態(tài)變化和運(yùn)動(dòng)。該族蛋白的活化能促使細(xì)

7、胞外基質(zhì)的降解、破壞上皮層的結(jié)構(gòu)和增加細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性。Rho族蛋白的活化和失活在真核細(xì)胞的許多基礎(chǔ)性生命活動(dòng)中都起著關(guān)鍵的作用。弓形蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞的過(guò)程伴隨著宿主細(xì)胞結(jié)構(gòu)的重組，包括宿主細(xì)胞中心粒及高爾基復(fù)合體定位在納蟲(chóng)泡上，線(xiàn)粒體、微管及溶酶體被納入了納蟲(chóng)泡的邊緣。
　　 有文獻(xiàn)報(bào)道，弓形蟲(chóng)感染宿主細(xì)胞時(shí)，免疫相關(guān)-GTP酶聚集在納蟲(chóng)泡膜上導(dǎo)致納蟲(chóng)泡膜的破裂及弓形蟲(chóng)的死亡，這種GTP酶在納蟲(chóng)泡膜上的聚集在弓形蟲(chóng)入侵幾分鐘后就開(kāi)始

8、了，然后在1小時(shí)內(nèi)逐漸增強(qiáng)。有研究表明宿主細(xì)胞的一種小分子GTP酶-ARF6參與了弓形蟲(chóng)侵入Vero細(xì)胞時(shí)納蟲(chóng)泡的形成。用RNAi的方法抑制Vero細(xì)胞中ARF6的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞對(duì)弓形蟲(chóng)的感染率顯著下降。并且ARF6在細(xì)胞膜上調(diào)節(jié)胞膜運(yùn)輸及肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組，研究者指出保持宿主細(xì)胞肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的完整對(duì)弓形蟲(chóng)的入侵非常重要。干擾素-γ-介導(dǎo)的GTP酶-Irga6可以抵抗小鼠被弓形蟲(chóng)感染，Irga6在未感染的細(xì)胞內(nèi)主要是以GDP非活

9、化結(jié)合狀態(tài)存在，但當(dāng)弓形蟲(chóng)感染細(xì)胞后Irga6會(huì)聚集在PVM上并且轉(zhuǎn)化為GTP活化狀態(tài)存在，Irga6的這種聚集最終導(dǎo)致PVM的破裂。此過(guò)程中需要一個(gè)完整的GTP結(jié)合域。其他原蟲(chóng)如隱孢子蟲(chóng)感染體外培養(yǎng)的人膽管上皮細(xì)胞時(shí)，誘導(dǎo)感染細(xì)胞中PI3K在納蟲(chóng)泡膜上的聚集與活化，F(xiàn)rabin也參與了納蟲(chóng)泡膜的形成，激活宿主細(xì)胞PI3K/Frabin信號(hào)通路，從而激活Cdc42通路，最終導(dǎo)致宿主細(xì)胞肌動(dòng)蛋白在納蟲(chóng)泡膜上的重組。GTP酶在弓形蟲(chóng)入侵宿主

10、過(guò)程中起所起的重要作用促使我們進(jìn)一步去探討，是否其它小分子GTP酶也同樣參與了弓形蟲(chóng)感染宿主細(xì)胞的過(guò)程。
　　 本實(shí)驗(yàn)的技術(shù)路線(xiàn)為是首先在弓形蟲(chóng)感染細(xì)胞中，證實(shí)RhoGTP酶組成到弓形蟲(chóng)PVM上，利用共聚焦顯微技術(shù)實(shí)時(shí)觀(guān)察弓形蟲(chóng)入侵細(xì)胞過(guò)程中，RhoGTP酶在PVM上的聚集過(guò)程。其次利用基因點(diǎn)突變的方法尋找決定Rho GTP酶在PVM上聚集的決定性結(jié)構(gòu)域，最后利用體外轉(zhuǎn)染的方法證實(shí)酶活性是否影響弓形蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞的效率。同時(shí)，運(yùn)

11、用GST pull down和對(duì)感染細(xì)胞用EGF刺激檢測(cè)聚集在PVM上RhoGTP酶的活化狀態(tài)。
　　 通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)在弓形蟲(chóng)速殖子入侵宿主細(xì)胞時(shí)，RhoA和Rac1 GTP酶可以聚集在弓形蟲(chóng)PVM上，這種聚集依賴(lài)的是完整的GTP酶活性，并且無(wú)論是弓形蟲(chóng)強(qiáng)毒株還是弱毒株RhoA和Rac1GTP酶在入侵時(shí)都會(huì)聚集。同時(shí)發(fā)現(xiàn)弓形蟲(chóng)在開(kāi)始入侵細(xì)胞時(shí)聚集就會(huì)發(fā)生且隨著入侵的繼續(xù)，PVM上的RhoAGTP酶仍不斷豐富聚集，推測(cè)此時(shí)聚集的GT

12、P酶來(lái)自宿主細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)，表皮生長(zhǎng)因子不能刺激RhoAGTP酶在PVM上聚集和轉(zhuǎn)移，這說(shuō)明RhoA和Rac1GTP酶在PVM上的聚集是以GTP活性形式存在。同時(shí)，弓形蟲(chóng)入侵可以激活細(xì)胞內(nèi)源性RhoA和Rac1 GTP酶。實(shí)驗(yàn)尋找到了決定RhoA GTP酶在PVM上的聚集決定于GTP/Mg2+結(jié)合及其下游效應(yīng)因子mDia結(jié)合相關(guān)的結(jié)構(gòu)域，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞微管蛋白來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組。使細(xì)胞內(nèi)RhoA和Rac1 GTP酶缺失，可以導(dǎo)致細(xì)胞弓形

13、蟲(chóng)速殖子感染率顯著降低，證明RhoA和Rac1GTP酶正?；钚栽诠蜗x(chóng)入侵細(xì)胞過(guò)程中是必不可少的。
　　 RhoA和Rac1 GTP酶在PVM上的聚集和弓形蟲(chóng)有效入侵時(shí)對(duì)RhoA和Rac1活性的依賴(lài)都顯現(xiàn)RhoA和Rac1 GTP酶在弓形蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞時(shí)發(fā)揮著重要功能及作用。宿主細(xì)胞的RhoA和Rac1 GTP酶在弓形蟲(chóng)入侵時(shí)參與了細(xì)胞骨架重組以促進(jìn)納蟲(chóng)泡的形成，細(xì)胞骨架的重組有利于弓形PVM的形成和擴(kuò)大，有助于維持弓形蟲(chóng)速殖子

14、在納蟲(chóng)泡內(nèi)的分裂繁殖。
　　 目的:
　　 1.分析在弓形蟲(chóng)感染宿主細(xì)胞時(shí)，宿主細(xì)胞的RhoA和Rac1 GTP酶是否組成到弓形蟲(chóng)的PVM上。
　　 2.了解RhoA和Rac1 GTP酶負(fù)顯性突變體是否組成到弓形蟲(chóng)的PVM上。
　　 3.分析弓形蟲(chóng)速殖子感染后宿主細(xì)胞內(nèi)源性RhoA和Rac1 GTP酶的活化狀態(tài)。
　　 4.探討RhoA GTP酶在弓形蟲(chóng)PVM上聚集時(shí)哪些結(jié)構(gòu)域是必須的。
　

15、　 5.分析聚集在PVM上的RhoA和Rac1 GTP酶的活性狀態(tài)是否依賴(lài)其本身的GTP酶活性。
　　 6.探討細(xì)胞RhoA和Rac1 GTP酶的缺失是否影響弓形蟲(chóng)速殖子入侵宿主細(xì)胞效率。
　　 方法:
　　 1.轉(zhuǎn)染pECFP-RhoA-WT和pECFP-Rac1-WT質(zhì)粒于COS-7細(xì)胞，48hr后細(xì)胞分別用弓形蟲(chóng)RH株和Pru株速殖子侵染2hr，4％多聚甲醛固定細(xì)胞30min后，用DAPI室溫下染色10

16、min，熒光顯微鏡下觀(guān)察CFP標(biāo)簽的RhoA和Rac1是否被組成到納蟲(chóng)泡膜上。
　　 2.弓形蟲(chóng)RH速殖子感染16HBE細(xì)胞后，用間接免疫熒光法對(duì)內(nèi)源性RhoA和Rac1進(jìn)行定位。
　　 3.弓形蟲(chóng)速殖子感染轉(zhuǎn)染pECFP-RhoA-WT于COS-7細(xì)胞后，在感染后用共聚焦顯微法每5min實(shí)時(shí)觀(guān)察宿主細(xì)胞RhoA GTP酶在PVM上的聚集情況。
　　 4.分別轉(zhuǎn)染RhoA和Rac1負(fù)顯性突變體(pECFP-Rho

17、A-N19和pECFP-Rac1-N17)于COS-7細(xì)胞中，48hr后用速殖子侵染2hr，4％多聚甲醛固定細(xì)胞30 min后，用DAPI室溫下染色10min，熒光顯微鏡下觀(guān)察非活化的RhoA和Rac1是否會(huì)聚集在納蟲(chóng)泡膜上。
　　 5.16HBE細(xì)胞用RH株速殖子感染后收集細(xì)胞，用RIPA試劑裂解，120 ug總蛋白用于Rho GST pull down，檢測(cè)弓形蟲(chóng)入侵是否激活RhoA和Rac1 GTP酶。
　　 6.

18、以pECFP-RhoA-WT為親本質(zhì)粒，構(gòu)建RhoA每10個(gè)氨基酸缺失的突變體19個(gè)即M1-M19。將M1-M19轉(zhuǎn)化入COS-7細(xì)胞，48hr后用RH株速殖子侵染2hr，4％多聚甲醛固定細(xì)胞30 min后，用DAPI室溫下染色10min，熒光顯微鏡下觀(guān)察各突變體RhoA在納蟲(chóng)泡膜上的聚集情況。
　　 7.COS-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染pECFP-RhoA-WT后速殖子侵染2hr，100 nM EGF加于六孔板一角，激活5min后用多聚甲醛

19、固定細(xì)胞，DAPI室溫下染色，熒光顯微鏡下觀(guān)察RhoA的轉(zhuǎn)位情況。
　　 8.宿主細(xì)胞RhoA和Rac1的活性及存在與弓形蟲(chóng)感染率關(guān)系的研究:
　　 a.正常COS-7細(xì)胞、COS-7細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染pECFP-RhoA-WT、pECFP-RhoA-N19和pECFP-Rac1-WT、pECFP-Rac1-N17，48hr后速殖子侵染2hr，多聚甲醛固定細(xì)胞，Giemsa染色，計(jì)算細(xì)胞感染率并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，比較正常細(xì)胞與轉(zhuǎn)

20、染細(xì)胞的感染率是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 b.正常16HBE細(xì)胞及單獨(dú)轉(zhuǎn)染RhoA-siRNA、Rac1-siRNA和共同RhoA-siRNA和Rac1-siRNA轉(zhuǎn)染組的16HBE細(xì)胞，用速殖子侵染2hr，多聚甲醛固定細(xì)胞，Giemsa染色，計(jì)算細(xì)胞感染率并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，比較正常細(xì)胞與轉(zhuǎn)染細(xì)胞的感染率是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)果:
　　 1.小分子GTP酶-RhoA和Rac1在弓形蟲(chóng)感染宿主細(xì)胞時(shí)會(huì)在PVM上

21、聚集。
　　 2.RhoA和Rac1 GTP酶在PVM上的聚集以GTP酶活性狀態(tài)存在。
　　 3.弓形蟲(chóng)速殖子的感染可以激活宿主細(xì)胞內(nèi)源性RhoA和Rac1 GTP酶。
　　 4.RhoA GTP酶依賴(lài)不同的RhoA結(jié)構(gòu)域在弓形蟲(chóng)PVM上聚集。
　　 5.細(xì)胞RhoA和Rac1 GTP酶為弓形蟲(chóng)速殖子有效入侵宿主細(xì)胞所必需。
　　 結(jié)論:
　　 1.無(wú)論弓形蟲(chóng)弱毒株還是強(qiáng)毒株速殖子，宿主細(xì)

22、胞RhoA和Rac1 GTP酶在弓形蟲(chóng)速殖子入侵時(shí)都會(huì)聚集在PVM上，而且這種聚集依賴(lài)其完整的GTP酶活性。
　　 2.弓形蟲(chóng)速殖子感染細(xì)胞可以激活內(nèi)源性RhoA和Rac1 GTP酶，并且在弓形蟲(chóng)剛開(kāi)始入侵時(shí)RhoA和Rac1 GTP酶就會(huì)在PVM上聚集，聚集的RhoA和Rac1 GTP酶來(lái)自細(xì)胞膜或者細(xì)胞質(zhì)。
　　 3.決定RhoA在PVM上聚集的結(jié)構(gòu)域有:GTP/Mg2+結(jié)合位點(diǎn)、Mdia效應(yīng)器作用位點(diǎn)、G1 box

23、、G2 box和G5 box。
　　 4.表皮生長(zhǎng)因子(EGF)刺激感染的宿主細(xì)胞后，RhoA和Rac1 GTP酶在PVM上并沒(méi)有發(fā)生移位現(xiàn)象，這顯示RhoA和Rac1可能以GTP活化形式存在于PVM上。
　　 5.細(xì)胞過(guò)表達(dá)pECFP-RhoA-WT、pECFP-Rac1-WT、pECFP-RhoA-N19、pECFP-Rac1-N17和將細(xì)胞內(nèi)RhoA和Rac1 GTP酶基因沉默后對(duì)細(xì)胞感染率的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示RhoA和