弓形蟲Trx體外表達(dá)的初步研究.pdf

1、目的：
　　克隆剛地弓形蟲硫氧還原蛋白（Thioredoxin, Trx）基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體，通過誘導(dǎo)表達(dá)和純化蛋白，免疫家兔制備多克隆抗體。構(gòu)建弓形蟲Trx的真核表達(dá)載體，使Trx基因在HepG2細(xì)胞中過表達(dá)。
　　方法：
　　采用PCR技術(shù)擴(kuò)增剛地弓形蟲Trx基因，克隆至原核表達(dá)載體pET-28a（+）中，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌（E. coli）Rosetta，用IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，利用鎳親和層析法獲得純化蛋白，

2、同時(shí)免疫家兔制備多克隆抗體。通過Western blotting鑒定多克隆抗體的特異性。
　　構(gòu)建Trx/p3XFLAG-Myc-CMV?-24真核表達(dá)載體，采用非脂質(zhì)體陽離子聚合物RonfectTM將載體轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞，Western blotting技術(shù)鑒定弓形蟲Trx基因在HepG2細(xì)胞中不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　成功從剛地弓形蟲cDNA中擴(kuò)增出Trx目的基因，構(gòu)建了Trx/pET-28a（+

3、）重組質(zhì)粒，獲得抗Trx重組蛋白的多克隆抗體。采用Western blotting檢測出弓形蟲Trx蛋白的特異性條帶。
　　成功構(gòu)建Trx/p3XFLAG-Myc-CMV?-24真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞24 h、48 h和72 h后，Western blotting技術(shù)在47.7 KD處檢測到均有特異性條帶出現(xiàn)，且Trx在HepG2細(xì)胞中48 h表達(dá)量最高。
　　結(jié)論：
　　制備的兔抗Trx多克隆抗體具有較高的