弓形蟲HSP70基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其誘導(dǎo)小鼠的細(xì)胞免疫應(yīng)答.pdf

1、目的：
　　 構(gòu)建弓形蟲RH株p3×Flag-CMW-14-TgHSP70真核表達重組質(zhì)粒。觀察不同劑量的重組質(zhì)粒p3×Flag-CMW-14-TgHSP70皮下肌肉注射免疫BALB/c小鼠誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答動態(tài)變化。
　　 方法：
　　 第一部分：設(shè)計合成TgHSP70引物，PCR擴增其基因片段，獲得弓形蟲速殖子熱休克蛋白(TgHSP70)基因編碼片段，雙酶切后與真核表達質(zhì)粒p3×Flag-CMW-14連接，連

2、接產(chǎn)物經(jīng)酶切、PCR及測序鑒定。脂質(zhì)體法將重組體轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞中，TgHSP70的表達產(chǎn)物通過RT-PCR和Western blot在基因和蛋白兩個水平進行鑒定。
　　 第二部分：125只BALB/c小鼠隨機均分5組，分別用50μg、100μg、150μg重組質(zhì)粒p3×Flag-CMW-14-TgHSP70/只皮下肌肉注射免疫小鼠3次，各間隔2周，空白對照組注射100μl Elution緩沖液，空質(zhì)粒組注射50μg p3

3、×Flag-CMW-14，重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒分別溶于100μl Elution緩沖液中。分別于首免后第2、4、6、8、10周摘眼球采血，分離血清，每組5只，ELISA法測定血清中IL-2、IFN-γ水平。頸椎脫臼處死小鼠，無菌取脾，分離脾淋巴細(xì)胞并計數(shù)；再加入終濃度為5μg/ml的ConA，5％CO2、37℃培養(yǎng)24h、72h，取培養(yǎng)上清。ELISA法測定培養(yǎng)24h上清液中IL-4、IL-2水平和培養(yǎng)72h上清液中IFN-γ水平。

4、　　 結(jié)果：
　　 PCR擴增獲得約495 bp的HSP70編碼基因片段，p3×Flag-CMW-14-TgHSP70重組體構(gòu)建成功，陽性克隆經(jīng)雙酶切、PCR及測序鑒定，基因片段序列完全正確。將 p3×Flag-CMW-14-TgHSP70真核表達重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中，經(jīng)RT-PCR檢測可見預(yù)期大小的目的基因條帶，Western-blot檢測表達產(chǎn)物大小約19 kDa。
　　 50μg、100μg、150

5、μg重組質(zhì)粒組小鼠血清IL-2水平在免疫后第6周明顯上升，第8周達到頂峰，第10周稍有回落。50μg、100μg、150μg重組質(zhì)粒組和對照組的血清IFN-γ水平隨時間改變基本一致，無明顯差異。免疫后第10周，50μg重組質(zhì)粒組脾細(xì)胞數(shù)（17.362x106個/ml）顯著高于150μg組（15.22x106個/ml）、lOOμg組（15.66x106個/ml）、空質(zhì)粒組（14.82x106個/ml）和空白對照組（16.076x106個/

6、ml）（F=4.478，P<0.05）。免疫后第2～10周150μg組脾淋巴細(xì)胞IL-4水平均高于50μg和100μg組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。免疫后第2～10周，50μg、100μg、150μg重組質(zhì)粒組和空質(zhì)粒組脾細(xì)胞IL-2水平均高于對照組，差異顯著（F=5.319，P<0.05），150μg重組質(zhì)粒組顯著高于其他各組。免疫后第2～10周，150μg重組質(zhì)粒組脾細(xì)胞IFN-γ水平顯著高于其它各組（F=3.918，P<0.05），并在

7、第8周（A405=0.9867）時達到最高值。
　　 結(jié)論：
　　 成功構(gòu)建了真核表達重組質(zhì)粒p3×Flag-CMW-14-TgHSP70。不同劑量重組質(zhì)粒p3×Flag-CMW-14-TgHSP70免疫小鼠均可誘導(dǎo)一定的細(xì)胞免疫應(yīng)答，150μg重組質(zhì)粒組誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞IL-2和IFN-γ水平優(yōu)于50μg、100μg重組質(zhì)粒組，50μg、100μg、150μg重組質(zhì)粒組在免疫后第8周誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答達到高峰。該重組質(zhì)粒