弓形蟲致密顆粒蛋白1(GRA1)的生物學(xué)功能研究.pdf

1、剛地弓形蟲是一類嚴格的胞內(nèi)寄生原蟲，呈全世界分布，可感染哺乳動物，鳥類，甚至冷血動物，弓形蟲有如此廣泛的宿主，除了與它強大的入侵機制有關(guān)之外，還和它強大的免疫逃避機制和適應(yīng)并改變宿主細胞環(huán)境的能力有著密切的關(guān)系。這也是導(dǎo)致弓形蟲病難以防控的主要原因。弓形蟲致密顆粒蛋白GRA16、GRA24、TgIST可利用宿主細胞信號通路進入宿主細胞核，調(diào)控宿主細胞表達，改變宿主細胞的免疫狀態(tài)和細胞內(nèi)環(huán)境，以實現(xiàn)免疫逃避和長期寄生。致密顆粒蛋白GRA1

2、7和GRA23可在納蟲泡膜上形成微孔，該孔可幫助弓形蟲攝取宿主營養(yǎng)，致密顆粒蛋白MAF1、GRA3和GRA5參與弓形蟲對宿主細胞線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的招募，幫助弓形蟲利用宿主營養(yǎng)。可以說，致密顆粒蛋白對于弓形蟲胞內(nèi)寄生十分重要。GRA1是第一個被發(fā)現(xiàn)的致密顆粒蛋白，但關(guān)于它的生物學(xué)功能我們知之甚少，研究它的生物學(xué)功能可以為進一步理解弓形蟲胞內(nèi)寄生的特性提供幫助，為以后的弓形蟲研究奠定理論基礎(chǔ)。
　　本研究以弓形蟲致密顆粒蛋白1（TgGR

3、A1）為研究對象，利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)和四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)(Tet-off)對TATi蟲株中的GRA1進行條件性敲除，成功構(gòu)建中間蟲株TATi-TetO7-GRA1蟲株，對其進行ATc處理，發(fā)現(xiàn)GRA1的表達不能被關(guān)閉，說明Tet-off系統(tǒng)不適用于GRA1的敲除。隨后改用Cre/loxP條件性敲除系統(tǒng)對RH△hxgprt蟲株中的GRA1進行條件性敲除，成功構(gòu)建中間蟲株RH△hxgprt-loxP-GRA1蟲株，復(fù)制實驗驗

4、證TgGRA1對弓形蟲胞內(nèi)寄生的重要性;同時，利用BioID技術(shù)，富集GRA1鄰近的蛋白，試圖發(fā)現(xiàn)更多潛在的致密顆粒蛋白和可能的GRA1互作蛋白。具體實驗內(nèi)容如下:
　　1GRA1蛋白原核表達和多克隆抗體的制備
　　構(gòu)建pE-SUMO-GRA1原核表達質(zhì)粒，該質(zhì)粒在表達感受態(tài)細胞BL21(DE3)中能夠順利表達，且蛋白表達在上清，將純化好的SUMO-GRA1蛋白進行動物免疫，收集免疫后的動物血清，用ELISA檢測抗體效價，結(jié)

5、果顯示該抗GRA1的多克隆抗體具有較高水平的抗體效價，經(jīng)Western blot檢測該抗體可特異性識別TgGRA1。
　　2TATi-TetO7-GRA1蟲株的構(gòu)建
　　利用Tet-off系統(tǒng)對GRA1基因進行條件性敲除。首先，構(gòu)建能夠識別GRA1基因座的pSAG1∷Cas9-U6∷sgGRA1的CRISPR質(zhì)粒和同源替換的模板質(zhì)粒pUC19-TetO7-GRA1。然后將擴增出來的同源替換片段5'UTR-DHFR-TetO7

6、-GRA1-3'UTR和pSAG1∷Cas9-U6∷sgGRA1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到TATi蟲株的速殖子中，乙胺嘧啶進行藥物篩選，再通過有限稀釋法進行TATi-TetO7-GRA1單克隆蟲株的篩選，單克隆經(jīng)擴大培養(yǎng)后用PCR進行鑒定，結(jié)果顯示成功獲得TATi-TetO7-GRA1蟲株。
　　用ATc處理TATi-TetO7-GRA1蟲株，經(jīng)間接免疫熒光檢測，GRA1蛋白的表達并未被關(guān)閉，蟲株生長也很正常。說明Tet-off系統(tǒng)不適用于GR

7、A1的敲除。
　　3RH△hxgprt-loxP-GRA1蟲株的構(gòu)建
　　利用Cre-loxP系統(tǒng)對GRA1基因進行條件性敲除。構(gòu)建同源替換的模板質(zhì)粒pUC19-GRA1-YFP，然后將擴增出來的同源替換片段5'UTR-tubulin-loxP-GRA1-loxP-YFP-HXGPRT-3'UTR和pSAG1∷Cas9-U6∷sgGRA1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到RH△hxgprt蟲株的速殖子中，用黃嘌呤和霉酚酸進行藥物篩選，再通過有限稀

8、釋法進行RH△hxgprt-loxP-GRA1單克隆蟲株的篩選，單克隆經(jīng)擴大培養(yǎng)后用PCR和間接免疫熒光進行鑒定，結(jié)果顯示成功獲得RH△hxgprt-loxP-GRA1蟲株。
　　4GRA1敲除株表型研究
　　RH△hxgprt-loxP-GRA1蟲株轉(zhuǎn)染能夠表達Cre重組酶的pmin-Cre-YFP質(zhì)粒，Cre重組酶會識別loxP序列，對RH△hxgprt-loxP-GRA1蟲株中的GRA1基因進行剪切，從而實現(xiàn)GRA1的

9、敲除。將GRA1敲除株與RH△hxgprt-loxP-GRA1蟲株進行胞內(nèi)復(fù)制實驗，發(fā)現(xiàn)GRA1敲除株和RH△hxgprt-loxP-GRA1蟲株相比，GRA1敲除株的復(fù)制能力顯著性下降。
　　5BioID技術(shù)富集GRA1的周邊蛋白
　　用Biotin標記經(jīng)過遺傳改造的RH△hxgprt-GRA1-BirA*蟲株，經(jīng)過24h作用，通過Western-blot檢測到RH△hxgprt-GRA1-BirA*蟲株有被生物素標記上的

10、特異蛋白，質(zhì)譜分析這些特異蛋白。經(jīng)過分析和對比，得到了17個已知GRA蛋白，同時找到了39個未知蛋白和16個已知蛋白。經(jīng)定位實驗鑒定，17個未知蛋白中有2個是致密顆粒蛋白，對16個已知蛋白進行功能分析，推測MYR1和GRA1存在互作的可能性，但它們之間具體的關(guān)系還需要進一步實驗驗證。
　　本研究主要利用Cre-loxP條件性敲除系統(tǒng)和CRISPR/Cas9技術(shù)在RH△hxgprt蟲株中對GRA1基因進行條件性敲除。GRA1敲除株和