兩株豬源剛地弓形蟲的分離及其生物學(xué)特性的研究.pdf

1、剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)是一種細胞內(nèi)寄生原蟲，在分類上隸屬項復(fù)門(Apicomplexa)、孢子蟲綱(Sporozoasida)、真球蟲目(Eucoccidia)、弓形蟲科(Toxoplasmatidae)、弓形蟲屬(Toxoplasma)。弓形蟲呈世界性分布，人和200多種動物都可感染，貓是終末宿主，人及其它動物均為中間宿主。弓形蟲病對人畜的危害很大，孕婦感染弓形蟲后導(dǎo)致早產(chǎn)、流產(chǎn)、胎兒發(fā)育畸形，是當(dāng)今致畸胎的四

2、大原因之一，也是免疫功能低下患者(如AIDS病人等)死亡的主要原因。動物感染很普遍，多數(shù)呈隱性感染，但豬可大批發(fā)病，死亡率高，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。
　　 弓形蟲的傳播途徑包括先天性感染和獲得性感染。人類的感染多數(shù)為獲得性感染，因生食含包囊的肉制品所致。豬肉是我國居民普遍喜食的肉品，養(yǎng)豬業(yè)是我國畜牧業(yè)中的支柱產(chǎn)業(yè)。受弓形蟲感染的豬肉可能是人體弓形蟲病的一個重要傳染源。因此，開展對豬源弓形蟲蟲株的研究不僅有助于對豬弓形蟲病流

3、行特征的了解以及診斷與防治，也有助于掌握弓形蟲的傳播規(guī)律，從而制定公共衛(wèi)生策略。為此，本文開展了以下研究。
　　 1、弓形蟲PCR檢測方法的建立
　　 國際標(biāo)準(zhǔn)株RH株經(jīng)腹腔接種ICR小鼠，3～5d后采集小鼠腹水，經(jīng)CF-11纖維素柱純化速殖子，提取蟲體DNA。以B1基因和529bp重復(fù)片段序列做為靶點基因，分別進行了單基因和雙基因PCR擴增，并優(yōu)化PCR反應(yīng)體系。結(jié)果表明529重復(fù)片段比B1基因的敏感性高10倍，前者相

4、當(dāng)于可檢測0.9個速殖子，后者可檢測9個速殖子;雙重PCR可檢測到約90個速殖子。
　　 2、豬源弓形蟲蟲株的分離
　　 對臨床上出現(xiàn)高溫、呼吸困難等癥狀以及剖檢在肝臟、肺臟、淋巴結(jié)、腸道等有出血、壞死等病變的獸醫(yī)院門診病豬進行了弓形蟲檢測。從25例病死豬中檢出5例陽性，陽性率達20％。對檢測為陽性的病死豬取臟器組織用ICR小鼠傳代，進行蟲體分離。取死亡小鼠腹水染色鏡檢，可見較多月牙形、半月形或橢圓形的蟲體，還可見假包囊

5、。成功分離出2株蟲體，分離成功率為40％。兩株分離株分別命名為YZ-1(家養(yǎng)野豬)和YZ-2(商品豬)。
　　 3、兩株豬源剛地弓形蟲的鼠毒力分析
　　 將2株分離株在小鼠體內(nèi)連續(xù)傳代，且傳代時每次經(jīng)腹腔接種的蟲體數(shù)相同，直至蟲體在小鼠穩(wěn)定寄生。以RH株為參考株，每個蟲株各設(shè)5個劑量組，分別經(jīng)腹腔接種梯度稀釋的速殖子。結(jié)果表明分離的2株豬源弓形蟲分離株對小鼠的毒力與RH株相同，經(jīng)腹腔接種10個速殖子致小鼠100％的死亡，

6、且死亡發(fā)生規(guī)律與RH株相似，因此將這2株豬源弓形蟲分離株鑒定為鼠毒力株。但2株豬源弓形蟲分離株GRA6基因的克隆與序列分析顯示，GRA6基因序列中同時存在15bp和3bp片段的缺失，與鼠弱毒株(BEVERLEY)的完全一致。
　　 4、兩株豬源剛地弓形蟲的基因型分析
　　 采用PCR-RFLP方法，以GRA6，PK1，AG2，c29-2，AG3，BTUB，c22-8，L358，Apico等9個常用分型基因位點對兩株豬源弓

7、形蟲分離株進行基因型分析，結(jié)果顯示，分離的兩株豬源弓形蟲的基因型完全一致，為非經(jīng)典型(atypical)，與報道的中國貓源株中Chinesel基因型完全一致。另外，兩株豬源弓形蟲分離株在PK1、GRA6和SAG2三個基因位點上的基因型均為Ⅱ型，且在進化樹分析中也顯示與基因Ⅱ型聚合在一個分支。
　　 5、兩株豬源剛地弓形蟲的ITS區(qū)序列分析
　　 對兩株豬源弓形蟲分離株的ITS及5.8S基因進行了克隆及序列分析，并與Gen