羊源弗氏檸檬酸桿菌的分離鑒定及其生物學(xué)特性研究.pdf

1、2014年河南省某規(guī)模化羊場的小尾寒羊大量死亡。病羊主要表現(xiàn)為可視黏膜發(fā)紺，然后突然倒地，四肢震顫，發(fā)出痛苦低沉鳴叫聲，常于發(fā)病后8-24 h突然死亡，病死率100％。為了確定導(dǎo)致小尾寒羊細(xì)菌性感染死亡的病原。對3只不同時間發(fā)病死亡的小尾寒羊進行系統(tǒng)剖檢，均呈現(xiàn)典型的敗血癥性病理變化。主要表現(xiàn)為腹腔有少量積液，肺臟、心肌、大腸、小腸和腎出血，肝、脾腫大并嚴(yán)重出血，腦輕度水腫。并從各組織臟器的病料中分離到3株細(xì)菌，命名為:LK-1、LK-

2、2和LK-3。常規(guī)生化鑒定結(jié)果表明3株分離菌與弗氏檸檬酸桿菌的生化特性相符。全自動微生物鑒定儀的鑒定表明3株分離菌均為弗氏檸檬酸桿菌，可能性超過99%。16s rRNA基因的比對分析表明與三者同源性最高的均為NCBI數(shù)據(jù)庫已發(fā)布的弗氏檸檬酸桿菌的16S rRNA基因序列，其同源性均在99％以上。系統(tǒng)發(fā)育樹表明LK-1株與日本弗氏檸檬酸桿菌NBRC16624株親緣關(guān)系最近。以上鑒定結(jié)果均表明3株分離菌為弗氏檸檬酸桿菌。
　　為了進一

3、步確定弗氏檸檬酸桿菌是否為小尾寒羊死亡的致病細(xì)菌。用LK-1株進行回歸試驗，經(jīng)人工感染LK-1株的健康小尾寒羊，可復(fù)制與自然發(fā)病羊相似的臨床癥狀和敗血癥病理變化，且從感染病羊各組織臟器中再次分離到相同的弗氏檸檬酸桿菌?；貧w試驗證實了弗氏檸檬酸桿菌對健康小尾寒羊具有較強的致病性，表明弗氏檸檬酸桿菌是該小尾寒羊致死性病例的病原菌。
　　取自然發(fā)病羊和人工感染羊的各組織臟器進行固定并制作病理切片，病理結(jié)果表明自然發(fā)病羊和人工感染羊的病理

4、變化相同，肺、脾、心和腦病理變化最嚴(yán)重。均表現(xiàn)為肺泡壁毛細(xì)血管充血、出血，肺泡內(nèi)充滿紅細(xì)胞和纖維素性滲出物。脾臟組織內(nèi)嚴(yán)重出血，脾小梁結(jié)構(gòu)變小甚至看不到脾小梁，有大量紅細(xì)胞浸潤。心肌纖維斷裂、間質(zhì)增寬、排列紊亂并有紅細(xì)胞和炎性細(xì)胞浸潤。腦組織輕度水腫，血管周圍有炎性細(xì)胞浸潤。
　　小鼠毒力試驗結(jié)果表明：3株細(xì)菌的LD50分別為5.0×107 CFU、6.0×107 CFU和5.8×107 CFU。藥敏試驗結(jié)果表明，3株弗氏檸檬酸桿

5、菌均對慶大霉素等12種藥物高度敏感。小鼠免疫保護試驗結(jié)果表明傳統(tǒng)的白油疫苗和新型GEL疫苗均能提供70%的保護率，并且兩者可以誘導(dǎo)相同的IgG抗體水平。根據(jù)藥敏和小鼠免疫保護試驗結(jié)果指導(dǎo)該養(yǎng)殖場用慶大霉素注射易感染羊群、用生石灰對地面消毒和LK-1株GEL佐劑滅活疫苗免疫所有成年羊和斷奶羊羔，取得了良好的治療和預(yù)防效果。
　　本文在國內(nèi)外首次報道了弗氏檸檬酸桿菌對小尾寒羊具有致病性。并為該病的致病機理、綜合防控和高效疫苗的研制、開