野鳥源新城疫病毒的基因組分析及其生物學(xué)特性鑒定.pdf

1、1926年至今，新城疫一直危害著世界養(yǎng)禽業(yè)，并對(duì)野生鳥類的健康構(gòu)成了潛在威脅。由于NDV在野鳥中存在廣泛的隱性感染，因此野鳥被認(rèn)為是NDV的天然貯存庫(kù)，調(diào)查野鳥攜帶NDV的狀況對(duì)ND的防控具有重要的意義。
　　本研究在2014年春季采集了558份野鳥糞便樣品，采用極限稀釋法對(duì)這些樣品中的NDV進(jìn)行分離和純化，結(jié)合血凝試驗(yàn)和RT-PCR的方法進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，558份樣品中共分離出17株NDV，分離率為3％。之后，我們對(duì)17株ND

2、V的F基因進(jìn)行T載體克隆和測(cè)序，使用生物學(xué)軟件對(duì)它們的核甘酸序列以及推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行分析,并將這些序列與國(guó)內(nèi)外NDV部分分離株的相應(yīng)核甘酸序列以及其推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行同源性比較和遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果表明，17分離株屬于NDV ClassⅡ類，其中10株基因Ⅰ型，7株基因Ⅱ型；基因Ⅰ型和基因Ⅱ型分離株的F基因的核苷酸和氨基酸分別于與V4株和La Sota株處于同一進(jìn)化分支。參考NDV ZJ-1分離株的基因組全序，設(shè)計(jì)11對(duì)引物擴(kuò)增其中

3、3株NDV（Wild bird/HN/150/2014，簡(jiǎn)稱―HN150；Wild bird/JL/TZ70/2014，簡(jiǎn)稱―TZ70；wild bird/JL/M50/2014，簡(jiǎn)稱―M50）基因組序列，分析3株NDV的6個(gè)編碼基因與參考株編碼基因的核苷酸和氨基酸的相似性，比較它們之間F和HN蛋白的序列差異。F蛋白功能區(qū)域分析結(jié)果顯示：HN150、TZ70與V4疫苗株相同，M50與La Sota疫苗株一致。對(duì)HN蛋白重要抗原位點(diǎn)分析表

4、明，M50與La Sota疫苗株的HN蛋白功能區(qū)一致，而HN150和70的HN蛋白第113位和350位氨基酸分別由R替換為Q，H替換為Y。此外，3株NDV的各基因與同型參考毒株各基因的相似性最高。
　　ICPI、IVPI以及MDT的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這3株病毒對(duì)SPF雞均呈低致病性。為確定3株病毒在雞體內(nèi)的適應(yīng)性和復(fù)制能力，我們以106EID50/100μL的劑量感染4周齡SPF雞，分別于感染后第三天和第五天采集它們的臟器、喉拭子和泄

5、殖腔拭子進(jìn)行病毒滴度檢測(cè)。組織嗜性結(jié)果顯示，3株NDV分離株都能在雞體內(nèi)全身性的復(fù)制，但是在3d.p.i，基因Ⅰ型NDV在小腸和氣管中復(fù)制增殖的速度快于它們?cè)谀X內(nèi)復(fù)制增殖的速度，5d.p.i時(shí)，基因Ⅰ型分離株HN150和基因Ⅱ型分離株M50在小腸內(nèi)的復(fù)制能力都顯著的高于它們5d.p.i時(shí)在腦內(nèi)的復(fù)制能力。對(duì)脾臟、胰腺和法氏囊中的病毒滴定結(jié)果表明，3株NDV分離株都能在這些臟器中復(fù)制增殖，5d.p.i時(shí)3株分離株在這三個(gè)臟器中的拷貝數(shù)都顯

6、著高于3d.p.i時(shí)的拷貝數(shù)。通過(guò)檢測(cè)HN150、TZ70、M50和La Sota之間交叉血凝抑制，以確定它們之間的抗原差異。血清交互實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：M50與疫苗株La Sota無(wú)抗原差異，R值為1.0；HN150、TZ70與La Sota存在抗原差異，分別為0.707和0.631。
　　野鳥作為NDV的貯藏宿主，在NDV的傳播與擴(kuò)散中的作用應(yīng)該引起足夠的重視。NDV分離地點(diǎn)和分離宿主的不同，使本研究野鳥源NDV分離株的基因型存在多

7、樣性：其中11株屬于基因Ⅰ型，7株屬于基因Ⅱ型。3株NDV分離株基因組全長(zhǎng)均為15186bp，未發(fā)現(xiàn)堿基的插入、缺失；HN150株、TZ70株與V4株的全基因組核苷酸的相似性分別為99.4%和99.0%，M50株與La Sota株的全基因組核苷酸的相似性為99%。3株NDV分離株的F蛋白氨基酸未發(fā)現(xiàn)替換或缺失，僅HN150株和TZ70株的HN蛋白出現(xiàn)兩個(gè)氨基酸的替換（Q113R, Y350H）。3株NDV分離株都能在雞體內(nèi)全身性的復(fù)制，