江蘇省新城疫病毒分子流行病學研究及鴿源分離株基因組序列的分析.pdf

1、新城疫(Newcastle Disease，ND)是由副粘病毒科、禽腮腺炎病毒屬中的新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)引起的多種禽類發(fā)生感染和死亡的一種急性、接觸性傳染病。目前NDV已經(jīng)在世界范圍內引起了四次大的流行，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。本文對分離自江蘇地區(qū)的20株NDV進行了囊膜糖蛋白基因(F、HN)的序列測定和遺傳進化分析，根據(jù)分析結果選取部分毒株進行了生物學特性的研究。同時，為豐富基因V

2、I型NDV的分子生物學信息，進而為深入了解基因Ⅵ型病毒的致病特性提供依據(jù)，本研究對分離到的四株鴿源基因VI型病毒進行了全基因組序列的測定及分析，并根據(jù)這些結果對鴿源基因Ⅵ型病毒的宿主特異性及毒力差異性的可能原因進行了初步探討。 1.新城疫病毒的分離鑒定及分子流行病學 2007-2008年自我國江蘇部分地區(qū)的發(fā)病禽群中共分離鑒定到1株鵝源、4株鴿源、1株鴕鳥源和14株雞源NDV。應用RT-PCR技術獲得了20株NDV的F基

3、因序列，遺傳進化分析表明，20株NDV中有2株基因I型、6株基因II型、4株為基因VI型，7株基因VII型，還有一株屬于classI毒株。序列相似性分析顯示，兩株基因I型病毒與疫苗株V4/Queensland/66的相似性最高，6株基因II型毒株與疫苗株LaSota的相似性最高，推測為疫苗毒；7株基因Ⅶ型病毒與F48E8的相似性在90％以下，而與VIId亞型病毒的相似性較高，為VIId亞型；一株classI毒株與中國近年分離的毒株相似性

4、高，而與DER49/99的相似性較低。由此看出，目前VIId亞型在我國禽群中仍然十分流行，并且禽群中疫苗株帶毒情況比較明顯，NDV在我國的流行已呈現(xiàn)出多種基因型并存的狀況。 對HN基因整個編碼區(qū)進行擴增，經(jīng)克隆、測序最終獲得了20株NDV的HN基因編碼區(qū)序列。對其編碼多肽長度進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，基因I型病毒編碼多肽長度為585或616個，6個基因II型病毒均為577個，4個基因Ⅵ型病毒和7個基因VII型病毒均為571個。根據(jù)HN基

5、因編碼區(qū)繪制的遺傳發(fā)生樹與根據(jù)F基因繪制的遺傳發(fā)生樹高度一致，進一步證實了NDV的演化是在基因水平上整體進行的。 對基因VI型、VII型病毒進行的MDT、ICPI、IVPI的測定結果顯示，基因VII型病毒的毒力與根據(jù)F基因裂解位點序列及HN基因編碼多肽長度確定的毒力結果一致，而對于基因VI型病毒，兩者之間存在偏差。分離株與針對NDV囊膜糖蛋白(F、HN)的單克隆抗體排譜實驗結果顯示：與HN蛋白單抗(681)不發(fā)生反應的毒株有增多

6、的趨勢。 2.四株鴿源新城疫病毒全基因組序列的測定及序列分析 通過RT-PCR技術對四株鴿源NDV的全基因組序列進行了擴增，經(jīng)克隆、測序獲得了四株病毒的全基因組序列。序列分析顯示，四株病毒全長均為15192個核苷酸(nucleotide，nt)，其中6堿基插入的位置與基因VII型病毒相同。根據(jù)F基因高變區(qū)繪制的遺傳發(fā)生樹顯示，這4株病毒與1987-2002年間歐洲及日本的分離株同屬于VIb亞型中的EU/re(recent

7、 European，EU/re)分支，顯示了這些地區(qū)在流行病學方面的相關性。根據(jù)全基因序列、F基因和HN基因分別繪制的3種遺傳發(fā)生樹高度一致，表明NDV的遺傳演化是在全基因組水平上進行的?；騐I型與其它基因型病毒之間各蛋白氨基酸序列相似性分析顯示：NDV6個基因中P基因的變異最大，而L基因相對保守：基因VI型病毒與基因II型病毒的相似性較低；而與基因IV、VII、VIII型病毒的相似性較高，這反映了基因VI型病毒與基因IV、VII、V

8、III型病毒之間在遺傳進化上存在一定的相關性。對鴿源病毒與雞源病毒各個基因編碼區(qū)氨基酸序列進行比較分析發(fā)現(xiàn)，鴿源毒株在NP、P、L上均出現(xiàn)了幾個特征性的氨基酸位點，分別是NP蛋白的463(N→D)、469(P→I)及477(P→H)位；P蛋白的10(D→E)、93(T-K/R)及163(R→G)位；HN蛋白的122(G→R)位；L蛋白的1110(L→T/A)及1757(A→V)位。在M、F蛋白上沒有發(fā)現(xiàn)特異的氨基酸位點，在HN蛋白上只發(fā)