鎮(zhèn)江地區(qū)博卡病毒分子流行病學(xué)及代表毒株比較基因組學(xué)研究.pdf

1、目的:
　　 兒童下呼吸道感染現(xiàn)在已成為兒科發(fā)病率最高的一種疾病，而90％以上的感染是由病毒引起。呼吸道病毒涉及7個病毒科的10多類共239個類別的病毒。2005年9月瑞典科學(xué)家Allander等，在呼吸道感染患兒鼻咽分泌物中發(fā)現(xiàn)的一種新的細小病毒—人博卡病毒(HumanBocavirus，HBoV)。此后，世界各地的研究證明博卡病毒不僅會引起小兒呼吸道感染，還會引發(fā)包括成人的病毒性腸胃炎疾病。目前世界各國對HBoV的研究主要集

2、中于檢測方法的建立和HBoV感染的流行病學(xué)調(diào)查。迄今為止，江蘇地區(qū)尚未有博卡病毒感染及流行相關(guān)報導(dǎo)。本研究通過PCR檢測鎮(zhèn)江及周邊地區(qū)呼吸道和胃腸道疾病患兒博卡病毒感染情況，并對獲得的HBoV基因序列進行生物信息學(xué)分析，以對該地區(qū)HBoV分子流行病學(xué)做初步研究;在此基礎(chǔ)上，本研究選擇3株鎮(zhèn)江地區(qū)HBoV代表毒株，對代表毒株的全基因組序列進行克隆測序，以此研究鎮(zhèn)江地區(qū)HBoV毒株遺傳特征，為該地區(qū)臨床HBoV感染的診斷和治療提供理論基礎(chǔ)。

3、
　　 方法:
　　 1.2010年1月至2011年12月，從鎮(zhèn)江市第四人民醫(yī)院檢驗科采集156份呼吸道疾病患兒鼻咽分泌液樣品和310份急性胃腸炎患兒糞便樣品，同時收集100份體檢健康兒童糞便樣品。提取病毒核酸，通過PCR方法檢測樣品中HBoV基因，對PCR擴增的590bp的陽性特異性條帶進行T-A克隆后送上海生工生物公司進行基因測序獲得HBoV基因序列片段。檢索GenBank中相關(guān)HBoV基因序列，與本研究中獲得的HB

4、oV基因序列共同構(gòu)建HBoV基因序列數(shù)據(jù)集以FASTA格式保存，通過CLUSTALW軟件進行序列數(shù)據(jù)集進行多重序列聯(lián)配，對生成的生成的＊.ALN文件進一步用MEGA4.0軟件進行序列同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析。
　　 2.在以上鎮(zhèn)江地區(qū)HBoV分子流行病學(xué)研究基礎(chǔ)上，選擇該地區(qū)3株HBoV代表毒株并提取病毒核酸，GenBank中提交的HboV全基因組序列設(shè)計7對引物，對3株代表毒株進行全基因組PCR擴增、克隆測序及全基因組序列拼接，獲

5、得鎮(zhèn)江地區(qū)HBoV代表毒株株全基因組序列;同時檢索GenBank中所有具有全基因組序列的HBoV毒株，與本研究中獲得的HBoV全基因組序列共同構(gòu)建HBoV基因序列數(shù)據(jù)集以FASTA格式保存，通過CLUSTALW軟件進行序列數(shù)據(jù)集進行多重序列聯(lián)配，對生成的生成的*.ALN文件進一步用MEGA4.0軟件進行序列同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析;用Simplot2.0及RDP3.0等軟件進行病毒基因重組可能性進行預(yù)測和分析。
　　 結(jié)果:

6、　　 1.PCR法檢測結(jié)果表明156份鼻咽分泌物樣品中有4份PCR擴增陽性，陽性率為2.56％;310份糞便樣品有11份PCR擴增陽性，陽性率為3.55％;糞便樣品陽性率大于鼻咽分泌物樣品。100份體檢健康兒童糞便樣品有1份PCR擴增陽性，陽性率為1.0％。測序結(jié)果分析表明16個DNA序列均為HBoV基因序列，且均與GenBank中提交的HBoV-1基因型毒株高度同源，提示鎮(zhèn)江地區(qū)流行的HBoV均為HBoV-1基因型。系統(tǒng)進化分析結(jié)果

7、進一步證實16株毒株均屬于HBoV-1，并聚類在3個主要類群中，提示鎮(zhèn)江地區(qū)有三種不同的HBoV-１毒株同時流行。序列同源性分析顯示該16毒株同源性為98.7％-99.6％，與分離自上海兒童的7株HBoV-1和重慶的3株HBoV-１同源性最高，均達到98％以上，從進化樹上看，該26個毒株聚類在同一大類群之中。
　　 2.在HBoV分子流行病學(xué)研究基礎(chǔ)上選擇毒株名為ZJ42、ZJ68及ZJ92的3株HBoV毒株為代表毒株進行全基因

8、組PCR擴增;結(jié)果顯示本研究設(shè)計的全基因組擴增引物均能擴增出HBoV特異性基因條帶，且目的條帶經(jīng)克隆測序后為HboV基因序列。序列拼接結(jié)果顯示HBoV-ZJ42全基因組序列共5301個核苷酸;毒株ZJ68和ZJ92具有相同的基因組長度為5300個核苷酸;以全基因組序列在GenBank中進行BLAST搜索，結(jié)果證實3株HBoV代表毒株均為HBoV-1基因型?；谌蚪M序列的系統(tǒng)進化分析結(jié)果顯示，本研究中的3株代表毒株聚類在三個不同的遺傳

9、類群中，其中ZJ92與來自我國香港的HBoV毒株HK24及上海的HBoV毒株SH8兩株毒株遺傳關(guān)系最近;ZJ42與來自泰國的毒株CU25緊密聚類在一起;而ZJ68與來自我國上海的R3080522001和SH1親緣關(guān)系最近?；贖BoV全基因組序列進行病毒基因重組分析結(jié)果顯示，包括本研究中代表毒株在內(nèi)的HBoV-1和HBoV-4之間存在明顯的基因重組信號，所有的HBoV-2毒株為該重組事件的重組毒株。該重組信號被進一步的序列同源性掃描和系

10、統(tǒng)進化分析所證實。
　　 結(jié)論:
　　 1.本研究中鼻咽分泌物樣品均采集自臨床上具有呼吸道疾病的兒童病例，而糞便樣品均采集自急性腹瀉兒童，因此，根據(jù)研究結(jié)果可以推測，HBoV感染與臨床兒童呼吸道疾病及急性腹瀉有一定關(guān)聯(lián)性。HBoV陽性率在不同地區(qū)有明顯差異，這可能是世界范圍內(nèi)不同地域的氣候、人群生活習(xí)慣及種族特征等不同因素所導(dǎo)致的。鎮(zhèn)江地區(qū)僅發(fā)現(xiàn)HBoV-１在兒童群體中流行，證明HBoV-1為該地區(qū)博卡病毒主要流行基因型

11、。系統(tǒng)進化分析結(jié)果表明鎮(zhèn)江地區(qū)的毒株與重慶和上海的毒株有共同的分子起源。
　　 2.本研究設(shè)計的HBoV全基因組擴增引物可以很好的擴增基因1型(HBoV-１)全基因組，可以給以后HBoV-１全基因組的擴增提供參考;鎮(zhèn)江地區(qū)3株代表毒株全基因組測序表明該地區(qū)博卡病毒主要流行基因型是HBoV-1;鎮(zhèn)江地區(qū)3株代表毒株可能有三種不同的遺傳起源，也說明在同一地區(qū)，即使是同一種基因型的HBoV也有可能有2種以上不同的亞群同時在人群中流行。