上海地區(qū)副豬嗜血桿菌分子流行病學(xué)調(diào)查研究及基因組文庫的構(gòu)建.pdf

1、副豬嗜血桿菌（haemophlius parasuis，HPS）屬巴氏桿菌科嗜血桿菌屬細菌，為革蘭氏陰性，小短桿至長絲狀，V因子依賴性非溶血性細菌，是豬上呼吸道的一種常在菌，在一定條件下可引起嚴重的全身性疾病，以纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為主要特征，該病原引起的疾病又稱為革拉氏病（Glasser’s disease）。該菌多與其他病原如豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒等混合感染，嚴重危害了仔豬和青年豬的健康。近年來由于該病的

2、頻繁發(fā)生，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴重的損失，因此倍受人們的關(guān)注。
　　 1.根據(jù)副豬嗜血桿菌16S rRNA基因設(shè)計了一對引物，通過最佳條件摸索擴增出大小為821bp的特異的目的基因片段，建立了快速檢測副豬嗜血桿菌的PCR方法。該方法最低檢出量達10-3ng，且對大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、傳染性胸膜肺炎放線桿菌和豬多殺性巴氏桿菌等多種常見細菌均無交叉性反應(yīng)。門診送檢的病料中用該PCR法檢測出4株副豬嗜血桿菌，并對分離株SH08-54

3、P的PCR擴增產(chǎn)物進行測序與比對分析，其與已發(fā)表的GenBank中的相關(guān)菌株的同源性為97.3％-100％。
　　 2.2008年2月至2009年5月間從來自于上海地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)殖場、屠宰場和上海市動物疫病預(yù)防控制中心門診的1518份樣品中，結(jié)合臨床特征、HPS的培養(yǎng)特性及形態(tài)、染色情況等對其進行了初步鑒定，初步分離了38株副豬嗜血桿菌疑似株。根據(jù)HPS16S rRNA基因設(shè)計合成引物建立特異PCR方法并結(jié)合生化特性試驗從38份樣

4、品中分離到24株HPS，總分離率為1.6％（24/1518），細菌來源主要為上海市動物疫病預(yù)防控制中心門診采集的臨床樣品，占70.8％（17/24），其余為豬場日常監(jiān)測的咽喉拭子及屠宰場豬肺、心等樣品。生化試驗結(jié)果表明，分離株與參考菌株均表現(xiàn)為吲哚、脲酶、山梨糖和甘露醇陰性，葡萄糖、麥芽糖和半乳糖陽性。并對這24株HPS進行藥敏實驗，結(jié)果表明所有分離株對阿奇霉素、頭孢拉定、菌必治、先鋒必、氧氟沙星和呋喃妥因較為敏感，然而已經(jīng)對新生霉素、

5、阿米卡星、林可霉素、紅霉素和慶大霉素等多種抗生素產(chǎn)生了嚴重的耐藥性，并且有加強的趨勢，提醒人們對濫用抗生素所帶來的隱患應(yīng)予足夠重視。血清學(xué)分型顯示分離株以血清5型和血清4型最為流行，所占比例分別為29.2％（7/24）和16.7％（4/24），其次為血清12、13和14型，其中4株分離株不能進行分型。
　　 3.利用稀有限制性位點聚合酶鏈反應(yīng)（IRS-PCR）對34株副豬嗜血桿菌進行基因分型研究，擴增出分子量在100-2000b

6、p之間的7-18條清晰的條帶，34株菌被成功分為Ⅰ和Ⅱ大類群。10株參考菌株中有8株和1/3的分離株屬Ⅰ類群，HS80，HS1075和2/3的分離株屬于Ⅱ類群，其中來自于南匯，奉賢和嘉定的所有分離株均屬Ⅱ類群，且同源性較高，遺傳相關(guān)系數(shù)大于0.60。IRS-PCR敏感性和穩(wěn)定性好，具省時省力等優(yōu)勢，是理想的副豬嗜血桿菌基因分型方法。
　　 4.選擇Sau3AI對HPS上海流行優(yōu)勢菌株SH08-54P不完全酶切獲取1-6kb的DN

7、A片段，以pUC18質(zhì)粒DNA為載體，用BamHI完全酶切、CIAP處理后與上述DNA片段連接構(gòu)建基因組文庫，獲得3.89×105個重組克隆子，符合建庫要求，隨機挑取24個克隆子經(jīng)PCR鑒定重組率為100％，且插入1kbDNA片段比例為92％，文庫構(gòu)建成功；利用超聲波裂解菌液與佐劑混合免疫SPF新西蘭大白兔制備抗血清，對用IPTG誘導(dǎo)后的文庫進行反復(fù)3次免疫篩選，最終獲得5個持續(xù)陽性克隆子，片段大小分別大約為0.7 kb，1.0 kb，