副豬嗜血桿菌OMP P2基因PCR檢測方法的建立與四川地區(qū)HPs分子流行病學(xué)調(diào)查.pdf

1、副豬嗜血桿菌病是由副豬嗜血桿菌(Haemophilus Parasuis，HPs)引起豬的一種常見的細菌性疾病，該病在我國的流行越來越廣泛，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了較大的經(jīng)濟損失，快速準確診斷和掌握流行病學(xué)規(guī)律對指導(dǎo)該病的防控非常重要。針對現(xiàn)有方法的不足，本研究建立了一種檢測HPs的PCR方法，并運用該方法對四川地區(qū)HPs進行了分子流行病學(xué)調(diào)查，掌握了近期四川地區(qū)HPs的流行與分布、部分基因的分子進化特征，為四川地區(qū)開展該病的防控監(jiān)測、流行風(fēng)

2、險分析、HPs基因數(shù)據(jù)庫的建立及疫苗研制等奠定了基礎(chǔ)。
　　1.副豬嗜血桿菌OMP P2基因PCR檢測方法的建立
　　本研究參照Genbank公布的HPs外膜蛋白P2基因，選擇其保守區(qū)域設(shè)計針對所有血清型HPs的PCR通用檢測引物，通過對退火溫度、引物濃度等條件的摸索優(yōu)化，成功建立了PCR快速檢測方法，將標(biāo)準菌株HS80 PCR產(chǎn)物序列進行測定和比對，結(jié)果表明序列同源性達97％～99％，證明了該PCR方法對靶序列克隆的準確性

3、。再以15個血清型的HPs標(biāo)準菌株和鏈球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、丹毒桿菌等7種參考菌株對該方法的特異性和重復(fù)性進行了驗證，結(jié)果顯示該方法特異性強重復(fù)性好，且可檢測到15個血清型的HPs菌株。靈敏性結(jié)果表明最低檢測量為173 CFU，靈敏性較高。同時，研究結(jié)果還表明該方法可快速準確檢測臨床疑似HPs病料。綜上所述，本研究建立的PCR方法特異性強、靈敏性高、重復(fù)性好，可用于對臨床疑似分離菌株的鑒定，也可用于HPs的分子流行病學(xué)調(diào)查。

4、　　2.四川地區(qū)HPs的分子流行病學(xué)調(diào)查
　　本研究于2013年6月至2013年12月期間在四川省成都、綿陽、樂山、眉山、雅安、廣安、南充、德陽等17個市縣20多個規(guī)?；i場收集疑似HPs病料131份，運用所建立的PCR方法進行檢測，累計檢出陽性病料26份，檢出率19.8％，陽性樣品均檢出于斷奶前后和保育階段病豬，來源地覆蓋了11個地區(qū)，表明HPs已在四川多個地區(qū)廣泛流行，主要危害斷奶前和保育階段的豬群，所以對該病的防控應(yīng)給予高度

5、的重視。通過對從陽性病料中分離的12株HPs和本室2009年分離的HPs的SC01株進行espp2基因克隆測序，并進行這13條序列核苷酸同源性、推導(dǎo)氨基酸同源性及其差異位點和遺傳進化樹構(gòu)建等分子特征分析，結(jié)果表明13株四川HPs分離株被分為兩個基因類群，且在核苷酸和氨基酸序列上具有高度的同源性。由此表明四川地區(qū)流行的HPs菌株基因型總體差異不大，同源性較高。綜上所述，HPs已在四川地區(qū)廣泛分布與流行，主要危害斷奶前和保育階段的豬群，四川