豬博卡病毒在我國部分地區(qū)的分子流行病學(xué)調(diào)查及其熒光定量PCR方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、細(xì)小病毒科中博卡病毒屬成員具有特征性的第三個(gè)開放閱讀框(Open ReadingFrame，ORF)，其中豬博卡病毒(Porcine bocaviruses，PBoVs)表現(xiàn)出最強(qiáng)的遺傳多樣性?；谝職さ鞍?Capsid protein，VP1)核苷酸及氨基酸序列進(jìn)行分類，將已經(jīng)報(bào)道的15株近全長序列分為了9個(gè)種:PoBoV1包含porcine boca-like virus(PBo-likeV)和PBoV1-H8,PoBoV2包含po

2、rcine parvovirus4-c14(PPV4-c14)和PPV4-c17,PoBoV3包含PBoV1、PBoV2和PBoV2-A6，PoBoV4-8分別包含6V，PBoV3-NI，PBoV4-NI，PBoV3-HK和PBoV4-1-HK、PBoV4-2-HK，PoBoV9包含7V和PBoV5。其中PoBoV3及PoBoV9各有2個(gè)基因型。對(duì)收集自中國2010年10省市的166份病料進(jìn)行PBo-likeV、PPV4、PBoV1、P

3、BoV2、6V、7V、PBoV3-NI及PBoV4-NI檢測(cè)顯示，其陽性率分別為28.9％、6.6％、9.0％、12.7％、22.3％、31.3％、15.1％和14.5％。PBoVs之間及其與其他常見病毒如豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，PRRSV)、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type2，PCV2)和豬瘟病毒(Cla

4、ssical swine fever virus，CSFV)共感染非常普遍。
　　 通過PCR方法擴(kuò)增了PoBoV1的NP1基因，將其連接到表達(dá)載體pET32(P3)中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒NP1-pET32(P3)。轉(zhuǎn)化后在大腸桿菌BL21(DE3)中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，獲得大小約55KD以可溶形式存在于菌體中的NP1重組蛋白。蛋白經(jīng)鎳柱純化后免疫實(shí)驗(yàn)兔，獲得抗血清。制備的血清通過ELISA發(fā)現(xiàn)抗體效價(jià)達(dá)到1∶64000，Weste

5、rn-blot鑒定顯示多抗能與NP1蛋白發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。
　　 根據(jù)當(dāng)時(shí)GenBank中公布的唯一PoBoV1基因組序列（登錄號(hào):FJ872544），針對(duì)其結(jié)構(gòu)蛋白VP1基因的保守序列，設(shè)計(jì)合成特異性擴(kuò)增引物及Taqman探針。以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的pPBoVZJ0901克隆質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品，通過對(duì)退火溫度、反應(yīng)總體系、探針濃度以及模板濃度進(jìn)行調(diào)整，建立了PoBoV1的Taqman熒光定量PCR方法。優(yōu)化反應(yīng)條件后，特異性檢測(cè)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)

6、，用該方法檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬源牛病毒性腹瀉病毒及其他基因型豬博卡病毒等結(jié)果均呈陰性，而檢測(cè)PoBoV1陽性病料呈陽性。敏感性檢測(cè)試驗(yàn)表明該方法在4.89×100copies/μl～4.89×109copies/μl范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低檢測(cè)限為4.89×100copies/μl。重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示組內(nèi)及組間變異系數(shù)均低于3％。用建立的熒光定量PCR方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)豬不同時(shí)期所采集的血清及處死后收集的各