雞新城疫病毒地方株的分離鑒定及其HN基因的克隆與序列分析.pdf

1、在河北保定地區(qū)兩個雞場中的發(fā)病雞群中，分離到兩株具有血凝性的病毒，經(jīng)血凝試驗和與多種陽性血清進(jìn)行血凝抑制試驗，確定兩株分離株均為新城疫病毒，并分別表示為HBB和HBW。對此兩株病毒的毒力進(jìn)行了鑒定，測定雞胚最小致死量平均死亡時間(MDT)分別為40.8h和53.7h；1日齡雛雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)(ICPI)分別為1.93和1.86；6周齡雞靜脈內(nèi)接種致病指數(shù)(IVPI)分別為2.89和2.72，結(jié)果表明：兩株NDV分離株均為新城疫強(qiáng)毒株。

2、 各取10只12日齡非免疫雞進(jìn)行攻毒試驗，所有雞只均在24小時內(nèi)開始發(fā)病，其中HBB株在72小時內(nèi)對試驗雞致死率達(dá)100﹪；HBW株在120小時內(nèi)致死率為80﹪；其余試驗雞則出現(xiàn)不可恢復(fù)性神經(jīng)癥狀。對高母源抗體(HI效價≥6log2)雛雞進(jìn)行攻毒試驗，HBB株使試驗雞在192小時內(nèi)全部死亡，致死率為100﹪；HBW株使試驗雞在192小時內(nèi)死亡4只，致死率為40﹪，其余耐過，均出現(xiàn)不可恢復(fù)性神經(jīng)癥狀。結(jié)果表明：兩株分離株對雞均有很

3、強(qiáng)的致病性，即使在高母源抗體存在條件下也能造成很高的發(fā)病率和死亡率，同時也證明了目前的傳統(tǒng)NDV疫苗已不能有效保護(hù)現(xiàn)在流行強(qiáng)毒株的攻擊，所以有必要針對本地區(qū)的毒株特點(diǎn)研制新的有效疫苗來防止目前新城疫的流行。 對兩株新城疫病毒分離株進(jìn)行大量增殖，經(jīng)透析膜濃縮后以TRNzol試劑法提取病毒RNA，參考文獻(xiàn)報道的一對特異性引物，利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增其部分HN基因片段，將瓊脂糖電泳檢測為陽性的RT-PCR產(chǎn)物，純化后連接到PBS-T

4、載體中，經(jīng)轉(zhuǎn)化E.coliJM109菌株進(jìn)行克隆，選擇白色陽性克隆菌落進(jìn)行測序；應(yīng)用DNAStar軟件對上述兩株NDV及國內(nèi)外已發(fā)表新城疫代表株的HN基因的核苷酸片段及其相應(yīng)的氨基酸序列進(jìn)行比較并建立系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明：兩株病毒分別擴(kuò)增出897bp的HN基因片段，編碼299個氨基酸，兩株病毒分離株HN基因核苷酸序列同源性為99.7﹪，氨基酸序列之間的同源性為99.3﹪，兩株病毒HN基因核苷酸與國內(nèi)外報道的相關(guān)序列同源性為82.8﹪～9