水禽源新城疫病毒經(jīng)雞傳代后HN蛋白變異的研究.pdf

1、新城疫(ND)是一種急性、高度接觸性傳染病，主要侵害雞和火雞，亦可感染其它禽類、鳥類和人。國際獸醫(yī)局 (Office Intemation des Epizooties,OIE)將其與高致病性禽流感同列為危害養(yǎng)禽業(yè)的必須報告的疫病，因此世界各國對本病的發(fā)生和流行均高度重視，在許多發(fā)達國家已消滅了本病。新城疫病毒(NDV)只有一種血清型，但不同毒株之間的毒力和致病性差異很大。在世界上曾有過三次大流行，其中兩次源于鸚鵡和鴿，其它禽類由來的N

2、DV在易感動物雞體中連續(xù)傳代后毒力增強的可能性很高。我們在前期研究工作中進行了NDV無毒株在雞體內(nèi)傳代的工作，即將從野生水禽的新鮮糞便中分離得到的無毒株 Goose/Alaska/415/91經(jīng)9代次的雛雞氣囊接種傳代(9a)和5代次雛雞腦內(nèi)接種傳代(5b)，分析每次傳代后分離株的毒力和分子結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果表明無毒株演變成了強毒株。F蛋白的基因序列分析結(jié)果表明，原代病毒無毒株的F蛋白裂解部位112-117位氨基酸序列具有典型的弱毒株模式，

3、即ERQER-L，而經(jīng)過14次的傳代則演化成典型的強毒特征，即KRQKR-F。 最近的研究表明：HN基因也被認為在NDV感染過程中起著重要的作用。在根據(jù)NDV基因的核苷酸和氨基酸序列對NDV分離株進行致病性分類時發(fā)現(xiàn)HN和F基因的變異具有很強的正相關(guān)性。在我們的前期研究工作中重點是放在原代病毒和繼代病毒的F蛋白裂解位點的突變株與致病性演化的關(guān)系上，結(jié)果表明：病毒在逐漸獲得致病性的同時，F(xiàn)蛋白基因發(fā)生著相應(yīng)的變異。而HN基因的變異

4、與NDV致病性的關(guān)系以及HN蛋白的變異規(guī)律正是本實驗的研究重點。 本實驗以原代病毒及其繼代共15代次病毒為研究材料，進行部分生物學活性的檢測，針對實驗獲得的15個NDVHN全基因的克隆進行測序與氨基酸序列的分析，研究HN基因的變異規(guī)律，對于NDV的致病性分子基礎(chǔ)提出新的理論依據(jù)。在實驗中將15代NDV分離株分別接種雞胚尿囊液進行增殖病毒，提取病毒基因組總RNA，進行RT-PCR．擴增HN基因，克隆入pGEM-T載體后，經(jīng)藍白斑篩

5、選，酶切鑒定，陽性克隆進行測序分析。經(jīng)過序列比對分析15代分離株的HN基因發(fā)現(xiàn)：經(jīng)過在氣囊傳兩代后，白2a(氣囊傳代2次)代起HN蛋白1717位堿基G突變?yōu)門，導(dǎo)致終止密碼子由<'1864>TAA<'1886>提前至<'1717>TAG<'1719>，這使得HN蛋白從616個氨基酸(aa)縮減為572aa，即少了一個44aa的尾，且一直保持到9a5b(氣囊傳代9次，再在腦內(nèi)傳代5次)代病毒。HN蛋白中糖基化位點、參與蛋白二聚體形成的半胱