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文檔簡(jiǎn)介
1、新城疫(Newcastle Disease,ND)由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus, NDV)引起,可致多種禽類死亡,給我國及世界養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的損失。NDV為副黏病毒科,禽腮腺炎病毒屬,單股負(fù)鏈RNA病毒,并且具有囊膜。其基因組結(jié)構(gòu)為3'-NP-P-M-F-HN-L-5',分別對(duì)應(yīng)編碼六種病毒結(jié)構(gòu)蛋白。
病毒感染細(xì)胞后各種各樣的免疫信號(hào)通路被激活,并產(chǎn)生抗病毒免疫反應(yīng)和炎性反應(yīng)來對(duì)抗病毒感染。模
2、式識(shí)別受體(PRRs)中的RIG-Ⅰ樣受體(RLR)是細(xì)胞質(zhì)中一類RNA解旋酶,它們可以通過其RNA配體結(jié)合病原相關(guān)分子模式(PAMP),識(shí)別非自身的病毒RNA。被感染的細(xì)胞中,這種相互作用可以通過觸發(fā)RLRs及包括MAVS在內(nèi)的其下游信號(hào)分子的活化,最終導(dǎo)致一型干擾素(IFN)的產(chǎn)生和炎性因子的產(chǎn)生,細(xì)胞做出抗病毒免疫應(yīng)答。然而,很多病毒通過保護(hù)自身RNA不被識(shí)別,或靶向RLR信號(hào)通路中的信號(hào)分子等作用,以逃避細(xì)胞的先天性免疫應(yīng)答。本
3、研究通過檢測(cè)NDV對(duì)MAVS的影響,來研究NDV對(duì)RLR信號(hào)通路的免疫逃避機(jī)制。
一、NDV感染細(xì)胞誘導(dǎo)MAVS降解
本研究分別使用了NDV三種毒株Herts/33、ZJ1、La sota感染HeLa和A549細(xì)胞,檢測(cè)RIG-Ⅰ樣信號(hào)通路中重要的接頭分子MAVS的表達(dá)水平的變化,結(jié)果顯示,三種毒株感染細(xì)胞前期都引起了MAVS表達(dá)水平的上調(diào),而在感染后期都幾乎完全降解MAVS。說明NDV在感染細(xì)胞前期強(qiáng)烈活化了RLR
4、信號(hào)通路的活化,而后期又幾乎完全破壞了RLR信號(hào)通路的信號(hào)的傳導(dǎo)。
二、NDV通過PCBP2非依賴途徑誘導(dǎo)MAVS降解
有研究已證明病毒可以通過上調(diào)PCBP2泛素化降解MAVS,并且有實(shí)驗(yàn)證明在敲低PCBP2的細(xì)胞中,NDV的復(fù)制受到抑制。為了驗(yàn)證NDV是否通過PCBP2降解MAVS,本實(shí)驗(yàn)使用了NDV三種毒株Herts/33、ZJ1、La sota感染HeLa和A549細(xì)胞,檢測(cè)PCBP2的表達(dá)水平的變化。結(jié)果顯示
5、NDV并沒有明顯地上調(diào)PCBP2,在敲低PCBP2之后對(duì)NDV復(fù)制也沒有影響,而在過表達(dá)PCBP2之后MAVS的表達(dá)量沒有明顯的降低。該結(jié)果表明,NDV并非通過上調(diào)PCBP2泛素化降解MAVS。
三、NDV通過蛋白酶體途徑誘導(dǎo)MAVS的降解
以上實(shí)驗(yàn)已證實(shí)NDV可以降解MAVS,而泛素-蛋白酶體系統(tǒng)作為一種重要的系統(tǒng),可介導(dǎo)真核生物體內(nèi)大部分蛋白質(zhì)的降解。為了驗(yàn)證NDV引起的MAVS的降解是否為泛素化降解,本實(shí)驗(yàn)選擇
6、了MG132作為蛋白酶體抑制劑處理細(xì)胞。結(jié)果顯示,使用蛋白酶體抑制劑之后,NDV引起的MAVS的降解受到了抑制,同時(shí)病毒的滴度也相應(yīng)的降低了,表明NDV引起的MAVS的降解是泛素化降解。
四、NDV病毒蛋白對(duì)MAVS降解檢測(cè)
為了驗(yàn)證NDV蛋白是否能直接降解MAVS,本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了ZJ1的P/V/W真核表達(dá)質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染ZJ1的PN/W真核表達(dá)質(zhì)粒以及實(shí)驗(yàn)室已有的Herts/33的P/M/NP真核表達(dá)質(zhì)粒后,檢測(cè)MAVS表
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