新城疫病毒河北分離株F基因的克隆、植物表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化馬鈴薯的研究.pdf

1、新城疫又稱亞洲雞瘟或偽雞瘟，是由新城疫病毒引起的一種禽類急性、高度接觸性、致死性傳染病。該病在世界各地迅速傳播，給養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大損失，被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為A類傳染病。目前世界上除部分發(fā)達(dá)國家采取撲殺措施外，大部分國家主要采用疫苗接種來防治本病。傳統(tǒng)的常規(guī)疫苗的研制都是以大量培養(yǎng)病原微生物為基礎(chǔ)的，這不僅給疫苗的制造帶來局限性，同時存在潛在的不安全因素，如病原微生物滅活不徹底，導(dǎo)致強毒散播；致弱的疫苗存在毒力返強問題等。而利

2、用植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)可食(飼)化疫苗，具有成本低廉，安全性好，生產(chǎn)速度快，接種簡單以及易于運輸?shù)葍?yōu)點，正在引起越來越多的科學(xué)家的關(guān)注。因此，利用轉(zhuǎn)基因植物研制可食(飼)化疫苗具有重要的意義和實際應(yīng)用價值。 以本實驗室保存的NDV地方分離株HBW-1全基因作為模板，根據(jù)GenBank已經(jīng)發(fā)表的序列設(shè)計一對引物，采用RT-PCR技術(shù)人工擴(kuò)增出了NDV HBW-1株F基因，將其克隆到載體中，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，得到的轉(zhuǎn)

3、化子經(jīng)分子量比較、PCR鑒定和酶切分析篩選陽性克隆。結(jié)果表明，得到的陽性重組子(pMD19-T)中含有F基因，且是正確插入到載體中的。F基因的測序結(jié)果與B1，BP01，LaSota，JS-2，CH2000等基因序列相比，核苷酸序列同源性為83.3％-99.1％，氨基酸同源性為87.9％-99.1％。 本研究選用新城疫病毒中毒力和免疫保護(hù)的關(guān)鍵蛋白-融合蛋白F全長基因作為目的基因，將其克隆到含CaMV35S啟動子控制下的植物表達(dá)載

4、體pBI121中，構(gòu)建了植物表達(dá)載體pBI121-F，經(jīng)酶切和PCR鑒定，表達(dá)載體的構(gòu)建完全正確。利用改進(jìn)的凍融法將其導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404，構(gòu)建了植物雙元表達(dá)載體。 利用構(gòu)建好的表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌LBA4404介導(dǎo)，轉(zhuǎn)化馬鈴薯愈傷組織，通過抗生素抗性篩選，共獲得32株抗性苗。對再生植株進(jìn)行PCR分析，初步證實外源基因己經(jīng)整合進(jìn)馬鈴薯基因組中。獲得陽性轉(zhuǎn)化再生植株1株，為利用馬鈴薯作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)新城疫新型食用性疫苗作了探